鐮刀菌對麥汁濁度的影響*

彭曉斌，劉春鳳，李永仙，李崎

(江南大學教育部工業(yè)生物技術重點實驗室，江蘇 無錫，214122)

鐮刀菌屬于真菌中的半知菌類，由于該屬的大型分生孢子多呈鐮刀狀而得名，是大麥赤霉病的主要病原菌，在溫度為16 ～24℃，相對濕度為85% ～90%時，會產生單端孢霉烯族毒素［1］，諸如:嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮、伏馬毒素等，對人和動物造成危害。其中嘔吐毒素含量較高，對啤酒釀造原料的影響最大，在濕熱的條件下由鐮刀菌于農作物在田間生長過程和制麥過程中產生［2］。嘔吐毒素的存在不僅對公眾健康造成危害［3－5］，同時也會對麥芽的品質造成影響，故不同國家與地區(qū)對食品中嘔吐毒素含量均有限量標準［6－7］。麥芽中的嘔吐毒素主要來自2 個方面，一是用含有嘔吐毒素的大麥來制麥，二是大麥在制麥過程中感染了鐮刀菌而產生。目前大多數(shù)研究主要針對第一種情況，一旦檢出毒素超標就停止使用，但是當碰到大麥毒素很低，制成麥芽后毒素超標，這時檢測出來就已經滯后。本研究特選擇了禾谷、燕麥、串珠、雪腐［8－10］4 株鐮刀菌，接種到正常大麥上，對其在制麥過程中產毒素的情況進行分析，試圖尋找染菌后麥芽的指標變化規(guī)律，以期為釀造者提供快速預判的可能。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

嘔吐毒素標樣，購自Sigma 公司，純度≥99%;甲醇，色譜純;其余均為國產分析純。

4 株鐮刀菌，購于中科院北京微生物研究所，主要情況見表1，制麥用大麥:蘇啤3 號，江蘇(2009，江蘇農墾麥芽廠)。

表1 4 株鐮刀菌詳細情況Table 1 The detailed information of 4 Fusarium spp.

Waters 液相色譜儀器，Waters 公司;IKA RV-10旋轉蒸發(fā)儀，德國東南科儀Brookfield;UV-2000 型紫外分光光度計，上海Unico 公司;SIGRIST 實驗室啤酒濁度計，美國南行儀器有限公司;2300 Kjeltec 型凱氏定氮儀，F(xiàn)OSS 公司。

1.2 檢測方法

1.2.1 麥芽中嘔吐毒素色譜分析

稱取20 g 麥芽樣品，粉碎至20 目大小，轉移到250 mL 具塞三角瓶中，加入8 mL 水和100 mL 萃取劑(氯仿與無水乙醇體積比為4∶1)，放置200 r/min搖床上1 h，過濾取50 mL 濾液，于45℃下旋轉蒸發(fā)干，再分別用50 mL 石油醚與30 mL 80%甲醇水溶液洗滌倒入250 mL 分液漏斗，搖勻靜置分層后，取下層液體，再于55℃下旋轉蒸發(fā)干，20%甲醇水溶液定容至2 mL，過0.45 μm 濾膜處理。采用色譜柱Zorbax Eclipose XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)［11］，流動相為甲醇－0.05%磷酸水溶液(20 ∶80，v/v)，柱溫30℃，流速1.0 mL/min，檢測波長210 nm。樣品與嘔吐毒素標樣分離的高效液相色譜圖見圖1。

1.2.2 常規(guī)指標檢測方法［12－15］

α-氨基氮，β-葡聚糖，木聚糖，考馬斯亮藍測蛋白質濃度，總多酚，麥芽總蛋白質與庫值，均采用分光光度法。

圖1 染菌麥芽樣品與嘔吐毒素標樣的色譜圖Fig.1 The HPLC of infected malt and deoxynivalenol standard

1.3 實驗方法

1.3.1 鐮刀菌的培養(yǎng)與孢子的收集與計數(shù)［16］

將購買的4 株鐮刀菌孢子接種到PDA 液體搖瓶中，于28℃180 r/min 搖床中培養(yǎng)3 ～5 d。待搖瓶中長出較多菌絲，將其分別接種到PDA 平板上，繼續(xù)于28℃下培養(yǎng)4 d，然后用牙簽點種至PDA 培養(yǎng)基上，等平板上孢子數(shù)較多時，用無菌水沖洗平板，收集孢子懸液，離心(2 000 ×g，8 min)，取離心管底物物質，用無菌生理鹽水振蕩重懸，計數(shù)。

1.3.2 制麥工藝［16］

浸麥(29 h):浸6 斷9 浸4 斷6 浸4;15 ℃;斷水時濕度控制在90%。

發(fā)芽(120 h):18 ℃24 h，15 ℃24 h，13 ℃48 h，16℃24 h;濕度控制在90 %。

焙燥(22 h):45 ℃5 h，50 ℃6 h，60 ℃6 h，70℃2 h，83 ℃3 h。

1.3.3 接種方式［16］

在第 1 次浸麥過程中分別接種禾谷(F.graminearum)、雪腐(F.nivale)、串珠(F． moniliforme)、燕麥(F.avenaceum)4 株鐮刀菌的孢子懸浮液，制麥所用大麥為400 g(水分12.75%)，按照孢子數(shù)102、103、104/g 絕干大麥的梯度分別接種，空白為未接種孢子。選擇在浸麥后取1 次樣，發(fā)芽過程中每隔1天取1 次樣，焙燥后取1 次樣，制麥時間共7d，每天取樣1 次，因此每株菌每個接種梯度下取7 次樣。

1.3.4 麥汁制備與麥芽理化性質分析［18］

采用協(xié)定糖化法對麥芽指標分析，對染菌麥芽的比重、浸出物濃度、千粒重、糖化時間、濾速速度、麥汁濁度進行分析檢測。

1.3.5 麥汁濁度測定

取過濾好的麥汁100 mL 放置到雙角度濁度儀，讀數(shù)即可。

2 結果與討論

2.1 制麥過程4 株鐮刀菌產嘔吐毒素情況

圖2 ～圖5 分別為禾谷(F.graminearum)、燕麥(F.avenaceum)、串 珠 (F.moniliforme)、雪 腐(F.nivale)4 株鐮刀菌在制麥過程中產嘔吐毒素具體情況。浸麥過程(第1 天)中由于經過水的洗滌，所以菌含量很少，毒素基本檢測不到，隨后發(fā)芽前期孢子萌發(fā)，鐮刀菌產生的毒素依舊很少，發(fā)芽后期(第4天和第5 天)由于菌量增加，毒素含量急劇增加，最高可以達到1.5 mg/kg，而烘焙過程中毒素含量變化不大。接種量為104孢子數(shù)/g 絕干大麥時，染禾谷、燕麥、串珠、雪腐鐮刀菌的麥芽毒素分別為1.55，1.31，1.26，1.19 mg/kg，超出了目前國家安全法規(guī)中對谷物的定量限度［7］，所以鐮刀菌對于釀造安全是存在潛在危害的。未接種鐮刀菌的大麥在制麥過程中毒素從0 增加到0.4 mg/kg，空白里面毒素增加，有可能是制麥大麥中存在鐮刀菌，其在發(fā)芽的濕熱條件下也產生了毒素。

圖2 制麥過程中禾谷鐮刀菌產毒素情況Fig.2 Deoxynivalenol content producted by F. graminearum during malting

圖3 制麥過程中燕麥鐮刀菌產毒素情況Fig.3 Deoxynivalenol content producted by F. avenaceum during malting

2.2 染菌麥芽相關理化指標分析

對染菌麥芽的相關理化指標進行分析，結果見表2。染菌麥芽與未接種鐮刀菌的麥芽千粒重、糖化時間差別不大，過濾速度有所加快，浸出物含量有所增加。而染菌麥芽麥汁的濁度明顯增大，染菌麥芽濁度為空白的2 ～2.7 倍。對于接種同一株鐮刀菌的麥芽來說，麥汁濁度和接種量成正相關，可能是鐮刀菌的接入導致了麥汁濁度的增大。

表2 不同鐮刀菌接種梯度下的染菌麥芽的指標分析表Table 2 Analysis of malts infected by Fusarium with different inoculum concentration

圖4 制麥過程中串珠鐮刀菌產毒素情況Fig.4 Deoxynivalenol content producted by F.moniliforme during malting

圖5 制麥過程中雪腐鐮刀菌產毒素情況Fig.5 Deoxynivalenol content producted by F.nivale during malting

2.3 染菌麥芽與濁度相關理化指標分析

為研究染菌麥芽協(xié)定麥汁濁度異常的問題，本研究對染菌麥芽的相關理化指標進行了分析檢測(見表3)，檢測方法見本文材料與方法1.2.2。

從表3 可以看出，接種4 株鐮刀菌的麥芽協(xié)定麥汁濁度都有不同程度的增加，空白麥汁濁度為2.04EBC，實驗組的濁度在2.45 ～5.58EBC。接種量為104孢子數(shù)/g 絕干大麥時，染禾谷、燕麥、串珠、雪腐鐮刀菌的麥芽麥汁的濁度分別為5.58、4.96、4.75、4.07 EBC。以禾谷為例，染菌麥芽的蛋白質與麥汁多酚與空白相比分別增加了20.2 mg/g 和37.0 mg/L，而β-葡聚糖與可溶性木聚糖含量則恰好相反，分別降低了73.11 和65.74 mg/L。麥汁中的濁度主要是由非淀粉質多聚糖顆粒(木聚糖和葡聚糖)，蛋白質顆粒，多酚-蛋白質凝聚物顆粒含量或皮殼碎片與未溶解的胚乳細胞顆粒造成的，而多酚與蛋白質之間通過脯氨酸鍵合在一起，慢慢形成晶核，從而導致濁度增加［17－18］。根據(jù)本研究的測定數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)麥芽中多酚與蛋白質含量增加，故認為染菌麥芽麥汁濁度增大主要是由于蛋白質與多酚增加引起的。β-葡聚糖和可溶性木聚糖含量有所降低，可能由于鐮刀菌在制麥過程中產生了β-葡聚糖酶與木聚糖酶等。

2.4 蛋白質含量與濁度大小相關模型的建立與分析

從表3 可以看出，蛋白質含量與濁度大小之間有明顯的線性關系，作蛋白質與濁度關系的散點圖(見圖6)

表3 染菌麥芽與濁度相關理化指標一覽表Table 3 The form of infected malt physicochemical index related to wort turbidity

圖6 蛋白質含量與濁度的散點圖Fig.6 The scatter diagram of protein and turbidity

經spss17.0 軟件分析蛋白含量、可溶性木聚糖、β-葡聚糖、多酚、α-氨基氮與濁度的相關性，其相關性分別為0.948、－0.896、－0.871、0.861、0.924，且檢驗值P＜顯著度0.05，說明這幾個變量與濁度具有相關性。α-氨基氮是由蛋白質降解得到的，α-氨基氮與蛋白質這2 個變量密切相關，用spss17.0 分析這2 個變量的偏相關性，假設其偏相關性為0，剔除α-氨基氮之后，蛋白質與濁度的相關系數(shù)為0.012，幾乎沒有相關性，即對濁度影響的2 個變量α-氨基氮與蛋白質，只要考慮蛋白質這一個變量對濁度影響就可以。

通過spss17.0 軟件對蛋白質與濁度進行多元線性回歸分析，獲得所擬合模型的情況簡報，顯示在模型中相關系數(shù)R為0.940，而決定系數(shù)R2為0.883，校正的決定系數(shù)為0.873。擬合優(yōu)度R2，表示自變量可以解釋因變量的變化量。

對所建立回歸方程模型進行方差分析，方差檢驗表中F 值對應的概率P值(0.000)＜顯著度0.05，因此應拒絕原假設，說明自變量和因變量之間存在顯著的線性關系，回歸模型成立，同時所用的回歸模型P值為0.000，因此我們用的這個回歸模型是有統(tǒng)計學意義的。

建立蛋白質(x，自變量)與濁度(y，因變量)一元線性模型y=ax+b，a 為0.181，b 為－18.877，且檢驗值P(0.000)＜0.05，可見常數(shù)項a 和蛋白質含量項系數(shù)b 都是有統(tǒng)計學意義的，故模型為:濁度=0.181 ×蛋白質含量－18.877。

經spss17.0 分析獲得沒有進入模型的各個變量的檢驗結果，模型中沒有引入的3 個變量P 值分別為0.186、0.158、0.935 均大于0.05，無需再進行分析了。分析蛋白含量、可溶性木聚糖、β-葡聚糖、多酚這幾個變量的偏相關性，剔除可溶性木聚糖、β-葡聚糖、多酚3 個變量后，發(fā)現(xiàn)蛋白質與濁度的相關性為0.779，且檢驗值P(0.008)＜顯著度0.05，說明在剔除其他變量影響后，蛋白質還是與濁度有較高的相關性，故將其納入模型建立的變量中。

下面對所建立模型:濁度=0.181 ×蛋白質含量－18.877，進行驗證，驗證結果與偏差見表4，發(fā)現(xiàn)除第一個濁度預測值與實測值之間偏差稍微偏大點，其他預測結果基本與實測結果吻合，說明當麥汁中蛋白質含量正常時，該模型的可信度不高，但是當?shù)鞍踪|含量過高時候，該模型才適用。

表4 根據(jù)蛋白質－濁度模型獲得濁度預測值及偏差表Table 4 The turbidity predictive value and deviation according to the model of protein and turbidity

3 結論

從制麥過程中4 株鐮刀菌接入的情況來看，在發(fā)芽后期，綠麥芽中嘔吐毒素含量均急劇增加，接種量為104孢子數(shù)/g 絕干大麥時，染禾谷、燕麥、串珠、雪腐鐮刀菌的麥芽毒素分別為1.55、1.31、1.26 和1.19 mg/kg，會對啤酒釀造造成潛在的危險。通過對染菌麥芽的分析，發(fā)現(xiàn)染菌麥芽的麥汁濁度大幅度增加。通過spss17.0 軟件分析麥芽的理化指標與濁度的多元線性關系，發(fā)現(xiàn)蛋白質含量對濁度的影響最大，建立蛋白質含量與濁度的相關模型:濁度=0.181 ×蛋白質含量－18.877。對于啤酒釀造者來說，如果發(fā)現(xiàn)麥汁濁度異常，除了對影響濁度的常規(guī)因素進行分析之外，還需對麥芽是否感染鐮刀菌毒素是否超標進行檢測。

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