不同氨基酸對普洱茶發酵過程中多酚類物質轉化及品質的影響

凌萌樂，劉通訊

(華南理工大學輕工與食品學院，廣東 廣州，510640)

普洱茶作為我國的傳統名茶之一，主要以云南大葉種曬青毛茶為原料，根據其后續加工工序的不同可分為“生茶”和“熟茶”，熟茶與生茶的區別在于，熟茶是經渥堆發酵和一系列后續工序快速成熟陳化而制得的。加工完成后的熟茶外形色澤紅褐，內質湯色紅濃明亮，香氣陳香而獨特，滋味醇和回甘，葉底紅褐，具有降血壓、降血脂［1］和抗衰老［2］等多種保健功效。在普洱熟茶的制作過程中，渥堆發酵是最為重要的一步，直接決定著產品的質量，所以改善渥堆工藝對普洱茶品質的提高有著重要的意義，目前，國內外關于工藝方面的探究主要集中在添加外源酶類、改變潮水量和人工接種微生物等方面［3］，并且在揭示品質的形成機理方面也進行了大量的研究［4］，但是對于通過添加外源氨基酸來改善發酵工藝以及發酵過程中酚類物質之間的轉化關系研究較少。氨基酸作為普洱茶發酵過程中的重要參與物質，其本身又是呈味物質，對普洱茶滋味和色澤的形成都起著非常重要的作用。本研究在一定潮水量、翻堆間期和翻堆次數的條件下，添加6 種具有代表性的外源氨基酸來探究其對普洱茶發酵過程中茶多酚、兒茶素和茶色素變化的影響，并對以上成分的相關性進行分析，得出它們在發酵過程中的變化規律。將最終發酵產品的感官評定和茶湯的光學特性與市售陳年普洱茶進行對比分析，以評價外源氨基酸對普洱茶發酵品質的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大葉種曬青毛茶(2011 年)云南騰沖;云南七子餅茶(03、05、07 年產熟普，中國云南西歐雙版納勐海國營黎明茶廠出品;谷氨酸、甘氨酸、賴氨酸、亮氨酸、丙氨酸和苯丙氨酸，上海伯奧生物科技有限公司。

ESJ200—4 電子分析天平，上海精科電子有限公司;UV752N 型分光光度計，上海棱光技術有限公司;富華420 型三用水箱，金壇市富華儀器有限公司;DHG90A 電熱恒溫鼓風干燥箱，上海索普儀器有限公司;CR-400 便攜式色彩色差計，Chroma meter;循環水式真空泵，鞏義市予華儀器有限責任公司。

1.2 實驗方法

加水增濕至茶堆含水量為45%，實驗組加入干茶重量0.6%的相應氨基酸［5］，對照組(CK)不添加氨基酸。然后進行實驗室模擬渥堆發酵，渥堆過程中，每6 天進行一次翻堆，共翻堆4 次，翻堆之前對茶堆的芯層和表層進行取樣［6］。(實驗進行時間2012年9 ～12 月，環境溫度為17 ～26℃)。

1.3 指標測定

茶多酚(TP)的測定:GB/T 8313 －2002;兒茶素總量的測定:香莢蘭素比色法;茶黃素(TF)、茶紅素(TR)、茶褐素(TB)的測定:比色系統分析法［7］。普洱茶的光特性分析方法:精確稱取普洱茶茶樣3.000g，加入150ml 沸水，沖泡5min，單層濾紙過濾，茶湯濾液冷卻至室溫后用色彩色差計測L*、a*、b*值，測定3 次，取平均值。

1.4 數據分析

用Microsoft Excel 2007 對數據進行處理與作圖，采用SPSS19.0 對數據進行方差分析、相關性分析和回歸分析。

2 結果與分析

2.1 不同氨基酸對普洱茶發酵過程中堆溫變化的影響

在普洱茶渥堆發酵過程中，適宜的溫度不僅為微生物的滋生和活動創造了良好條件，也為茶葉內含物質的轉化和生成創造了條件，這對酚類物質的氧化聚合尤為重要，所以在普洱茶發酵前期保持一定的堆溫對普洱茶品質的形成有著重要的作用。由圖1 可知實驗組在渥堆前期(7d 之前)堆溫明顯高于對照組，最高溫度達48 ～55℃，說明外源氨基酸能夠增強發酵過程中生化反應，加快反應產熱，使堆溫達到較高的水平，從而有利于茶葉內部物質的轉化和生成。當發酵進行到一定程度時，生化反應活性降低，堆溫隨之降低。

圖1 不同氨基酸處理下渥堆過程中堆溫的變化Fig.1 Changes of pile temperature during fermentation process under different amino acids treatment.

2.2 不同氨基酸對普洱茶發酵過程中茶多酚和兒茶素含量變化的影響

茶多酚和兒茶素在很大程度上決定了茶葉的滋味，并且這兩者又是生成茶色素的前體物質，與茶色素的變化緊密相關，所以其變化對普洱茶的滋味和色澤有著重要的影響［8］。實驗結果表明，第4 次翻堆結束后，茶多酚減幅最大的是谷氨酸組，達92.1%(表層和芯層減幅的平均值，下同);減幅最小組為亮氨酸組，達67.3%。由圖2 －A 可知，與對照組相比在渥堆前期外源氨基酸對茶多酚的減少量影響不大(P＞0.05)，說明外源氨基酸與茶多酚的減少和轉化的關系不明顯，但實驗組總體的減幅均大于對照組的66.7%，這可能是由于茶多酚作為一種混合物，它包含類黃酮、黃酮類、黃酮醇類、花色苷類、異黃酮等物質［9］，它的減少和變化受到如發酵過程中的濕熱環境、多酚氧化酶酶活等眾多因素的影響。

兒茶素屬黃烷醇類物質，是2-苯基苯并吡喃的衍生物，性質活潑，約占多酚總量的70% ～80%。兒茶素的B 環酚羥基易氧化形成鄰醌，而鄰醌又很不穩定，易發生復雜的聚合、縮合反應，而形成雙黃烷醇類、茶黃素類和茶紅素類等［10］。由圖2 －B 可知，在二翻之后，外源添加氨基酸能明顯加快兒茶素的減少和轉化，三翻時對照組與實驗組兒茶素含量的差異達到極顯著水平(P ＜0.01)，四翻結束后，兒茶素減幅最大的是亮氨酸組達97.4%，減幅最小組苯丙氨酸組達94.85%，均大于對照組的84.8%。在兒茶素氧化的過程中，氨基酸與其氧化產物結合，通過氧化脫氨和偶聯氧化途徑，生成相應的醛類等獨特的香氣化合物，形成茶葉的基本風味。實驗結果表明添加外源氨基酸能加快兒茶素的氧化和轉化，兒茶素的氧化聚合產物是茶色素形成的前提物質，所以，這一反應將對接下來茶黃素、茶紅素的變化和茶褐素的積累產生重要影響。

圖2 不同氨基酸處理下發酵過程中茶多酚(A)和兒茶素(B)含量的變化。Fig. 2 Changes of tea polyphenols(A)and tea catechins(B)content during fermentation process under different amino acids treatment.

由以上結果可知，在普洱茶的發酵過程中，茶多酚和兒茶素的含量不斷減少，降低幅度在一翻到三翻之間較大，這與梁明志等［11］研究普洱茶渥堆發酵過程中理化指標的變化得出的結果一致。在同樣的時間內，實驗組的茶多酚和兒茶素的減幅總體大于對照組，并且也大于其他工藝條件下的降低幅度［12－13］，表明添加外源氨基酸之后能夠加快茶多酚和兒茶素含量的減少，從而降低茶湯的苦澀味，促進普洱茶醇厚回甘的特點的形成。周錫樑等［14］同樣在綠茶的加工過程中采用噴灑氨基酸的工藝來降低酚氨比，進而改善茶葉滋味，降低苦澀味。

2.3 不同氨基酸對普洱茶發酵過程中茶色素含量變化的影響

茶色素包括水溶性的茶黃素、茶紅素和茶褐素，它們是兒茶素氧化分解聚合的產物，這3 種物質在很大程度上決定了茶湯的滋味和色澤。由圖3 －A 可知，實驗組和對照組在一翻時茶黃素的含量大于茶原樣(曬青毛茶)，但含量變化沒有一定的規律性，其原因可能與茶黃素的動態變化有關，茶黃素是由兒茶素等多酚類物質經酶促氧化生成，它是生成茶紅素和茶褐素的前提物質，所以它的含量一直處于動態變化之中;由圖3 －B 可知，茶紅素的含量從一翻到四翻不斷減少，與對照組相比，實驗組茶紅素含量在一翻到二翻之間有極顯著下降趨勢(P＜0.01)，同茶原樣相比有較大的減少，從三翻到四翻，茶紅素含量一直處于較低水平，這可能是因為茶紅素屬于中間過渡產物，發酵前期有前體物質的不斷生成，但是到了后期前體物質生成減少，自身又不斷被氧化，所以造成含量處于較低水平;由圖3 －C 可知，實驗組茶褐素含量從發酵開始到三翻不斷積累，三翻時達到最大值，其含量介于6.315% ～8.108%，達到羅龍新等［15］在研究中得出的最佳湯色品質的茶褐素含量標準，在三翻之后茶褐素的含量有所下降，這在感官評價上為色澤變淺，這可能是由于添加氨基酸后茶葉內含物質的轉變和轉化反應過于激烈，從而使得茶褐素等物質轉變為其他的物質，進而影響茶葉的品質，而對照組茶褐素從一翻到四翻不斷積累，并且各階段含量均低于實驗組。

多酚類物質在濕熱、微生物作用下發生酶促和非酶促氧化，通過氧化聚合，生成橙黃色的茶黃素，再進一步氧化產生紅色的茶紅素，茶紅素很快又氧化并與含氮物質、糖類、咖啡因等物質結合，而形成暗褐色的茶褐素［16］。由本實驗結果可知，若從多酚類物質依次氧化順序產物(茶黃素-茶紅素-茶褐素)來看，茶黃素由于處于較前位置，其變化沒有一定的規律性，茶紅素與茶褐素有直接的轉化聯系，所以其含量變化有較明顯的線性關系。通過與對照組相比，實驗組中茶褐素能較快的積累，其含量在二翻時達到顯著水平(P＜0.05)，三翻時達到極顯著水平(P＜0.01)，而茶褐素又是普洱茶中十分獨特的品質成分，直接決定著普洱茶的品質［17］。此外，本實驗也證明了外源氨基酸可以加快酚類物質向茶色素的氧化轉變以及茶色素之間的轉化和茶褐素的積累，氨基酸參與這些過程的途徑可能為氨基酸與多酚類物質或者其氧化聚合產物發生反應，或者氨基酸與糖類物質發生美拉德反應，這些產物又與多酚類物質或者其氧化聚合產物相結合［18］。

圖3 不同氨基酸處理下發酵過程中茶紅素(A)、茶黃素(B)和茶褐素(C)含量的變化。Fig.3 Changes of theaflavins(B)，thearubigins(B)and theabrownins(C)content during fermentation process under different amino acids treatment.

2.4 不同氨基酸處理下的普洱茶發酵過程中茶多酚、兒茶素和茶色素之間的相關性

茶多酚是一類存在于茶葉中的多元酚類混合物，其中以兒茶素為主體，而茶黃素、茶紅素和茶褐素是普洱茶的主要著色物質，目前認為這3 種物質是茶多酚的水溶性氧化產物［19］，研究他們的之間的相關性對于理解他們相互之間的氧化、降解和轉化機理提供一定的理論依據，同時也能得出外源氨基酸對該變化過程的影響。所以，對不同氨基酸條件下發酵過程的指標進行相關性分析和多元回歸分析。結果見表1和2。

表1 發酵過程中各項指標的相關系數及其顯著性檢驗效果Table 1 Correlation coefficients of indexes and significant test results during fermentation process.

由表1 可知，在添加氨基酸的條件下，茶多酚與兒茶素、茶紅素含量呈極顯著的正相關，與茶褐素呈極顯著負相關(P＜0.01)，表明隨著茶多酚含量的降低，兒茶素和茶紅素含量也同時降低，茶褐素的含量則不斷積累。兒茶素同茶黃素和茶紅素呈極顯著的正相關，同茶褐素呈極顯著的負相關，這表明兒茶素同這3 種色素之間的轉化有著直接關系。茶黃素同茶紅素呈顯著的正相關(P＜0.05)，同茶褐素的相關性不顯著，說明了茶黃素同茶紅素的轉化關系更為緊密和直接。茶紅素同茶褐素呈極顯著的負相關(P＜0.01)。

在普洱茶的加工過程中，茶褐素的含量明顯增加，這對于普洱茶的品質的形成有著十分重要的作用［20］。為了分析影響茶褐素含量變化的因素，以茶褐素含量(Y)為因變量，茶多酚(X1)、兒茶素(X2)、茶黃素(X3)、茶紅素(X4)的含量為自變量進行逐步回歸分析，建立多元線性回歸方程。結果見表2。將茶褐素與茶多酚、兒茶素、茶黃素和茶紅素含量之間的線性關系經逐步分析后，引入回歸方程的變量為兒茶素和茶黃素。同時由這2 個指標的標準偏回歸系數來看，對茶褐素的作用是茶黃素大于兒茶素，對方程的方差分析及對回歸系數的顯著性檢驗表明，所建立的回歸方程擬合效果理想。得到的回歸方程可以把普洱茶發酵過程中茶褐素同兒茶素和茶黃素之間的關系量化，從而為普洱茶發酵過程中茶褐素、茶黃素的形成，兒茶素的氧化聚合或者降解提供一定的理論依據。

表2 多元回歸分析結果Table 2 Results of multiple regression analysis

2.5 不同氨基酸處理下的發酵終產品與陳年普洱茶的對比分析

根據感官評定和相應的指標變化，確定在添加外源氨基酸的條件下發酵19d(三翻后1d)，普洱茶的湯色、香氣和滋味均達最佳，然后取樣在室內晾干，為發酵終產品。通過將發酵19 天的對照組普洱茶與3種陳年普洱茶的感官評定和光學特性進行對比分析，來評價發酵終產品的品質，結果見表3。由表可知，同對照組和陳年普洱茶相比，氨基酸處理的發酵終產品的湯色、香氣和滋味均達到較高品質要求，L* 值同陳年普洱的基本保持一致，達到了陳年普洱茶的亮度標準;a* 和b* 值同陳年普洱茶的相差不大，說明了其較好的色澤，而對照組不管是感官還是光學特征均與陳年普洱茶相差較遠。總的來說添加氨基酸的發酵終產品不管在色澤還是內質，均能夠形成陳年普洱茶的品質，所以外源添加氨基酸處理能夠很好的改善普洱茶的發酵過程，進而形成陳年普洱茶的優良品質。

表3 不同儲存年限和氨基酸處理下的普洱茶感官評定和茶湯色分析(M±SD)Table 3 Sensory evaluation and color analysis of Pu-erh tea with different storage life and amino acids treatment.

(注:L* 為明度指標，從大到小由白色向黑色漸變;a* 為紅綠色度指標，正值表示紅色指標，負值表示綠色指標;b* 為黃藍色度指標，正值表示黃色指標，負值表示藍色指標)

3 結果與討論

(1)外源氨基酸可以在發酵前期提高發酵溫度，這可能是由于氨基酸作為氮源直接被微生物利用，影響發酵過程中微生物的新陳代謝，使其分泌豐富的胞外酶，這將對普洱茶內含成分的物理化學變化產生極大的促進作用。

(2)外源氨基酸可以在發酵過程中加快酚類物質轉化，在發酵過程中，多酚類物質在微生物所分泌的酶及濕熱的作用下，被氧化成初級產物鄰醌，氨基酸可被生成的鄰醌氧化，脫去氨基和羰基形成相應的揮發性醛類，外源氨基酸可以加大該反應的程度，此外，氨基酸與兒茶素在一定溫度下可生成(7-C-乙基氨基酰-(-)-表兒茶素)，該物質將進一步變成棕褐色物質［21］，這些反應及其產物將對普洱茶的色、香、味產生很大的影響。

(3)外源氨基酸能加快茶褐素積累，茶褐素的形成存在酶促反應機制和非酶褐變機制，酶促反應主要是多酚類的氧化聚合或氧化產物的偶聯聚合，在該過程中氨基酸作為一種重要物質參與其聚合反應;非酶褐變機制主要是美拉德反應，即氨基酸和糖等含羰基化合物中的羰基之間的縮合作用，前面的結果表明外源氨基酸能夠促進這2 種機制的進行，進而加快茶褐素的積累。

(4)外源氨基酸可以縮短發酵周期，加快普洱茶特殊品質的形成，在相同工藝條件下，添加外源氨基酸發酵19d 即可形成普洱茶湯色紅亮、醇厚回甘的品質特點，這與外源氨基酸能夠加快多酚類物質的轉化和茶褐素的積累緊密相關，而對照組則需要25d 才能形成相似的品質，此外添加外源氨基酸發酵的普洱茶能形成明顯的滋味特征，比如添加苯丙氨酸發酵普洱茶具有蘭花香，丙氨酸的具有木香，這可能與微生物作用和氨基酸本身的呈味性有關［22－23］。

總之，氨基酸可以在微生物的作用下或者其自身直接影響發酵過程中茶葉內含物的生化轉變，加快普洱茶的發酵進程，提高普洱茶的發酵品質。所以，通過添加外源氨基酸的方法來改善普洱茶的發酵環境，縮短發酵周期，提高品質，同時開發新的普洱茶品種將是接下來的研究目標和重點，本文為以后的研究奠定了一定的基礎。

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