單萜醇類在啤酒發酵過程中的變化及對酒花香氣的貢獻*

全巧玲，江偉，王德良，孫志偉，宋濤

1(新疆農業大學食品科學與藥學學院，新疆 烏魯木齊，830052)

2(中國食品發酵工業研究院釀酒工程技術研究發展部，北京，100027)

啤酒的香氣成分復雜，其中由酒花添加而帶給啤酒的獨特香氣稱為啤酒的酒花香氣，通常被描述為花香、柑橘香、水果香、松脂味和辛辣味等。至今為止，啤酒酒花香氣仍是一個頗具爭議的話題，但業界普遍認為酒花中貢獻啤酒酒花香氣的物質主要是萜類化合物［1－2］。酒花萜類分萜烯類和萜醇類，在啤酒中檢測到的α-蒎烯、β-蒎烯、香葉烯、檸檬烯、葎草烯、法尼烯和石竹烯［3－4］等萜烯類物質具有強疏水性，在煮沸過程中因高溫蒸發而大量損失，促使其在啤酒中的含量遠遠低于其感官閾值，因此對啤酒酒花香氣強度的貢獻可以忽略［1］。而里那醇、香葉醇、β-香茅醇、香葉酸甲酯、乙酸香葉酯等萜醇類化合物及其衍生物在啤酒中的含量為數μg/L 至數十μg/L［5－6］，對啤酒酒花香氣的貢獻明顯，尤其是里那醇數年來一直被認為是評價啤酒酒花香氣的“標志性化合物”［7－9］，含量達到16 μg/L 就能很容易辨識［7］。近年來，專家們認識到啤酒的酒花香氣十分復雜與來自酒花精油中風味活性物質的生酒花味道截然不同［10］，沒有哪種單一物質可以代替［11－12］，尤其是這些萜類物質在發酵過程中通過生物化學變化生成的其他物質能極大地影響啤酒的香氣類型和強度［10］:King 等人發現，香葉醇主要轉化為β-香茅醇，其次是里那醇;里那醇主要轉化為α-萜品醇，且α-萜品醇的轉化仍會進一步進行［3］。這些單萜醇的生物轉化并非自發形成，其中酵母菌起著重要的作用，酵母不同其轉化途徑和生成的物質也不盡相同［3，13］。此外，在不同的濃度下這些萜烯醇物質的其存在形式和作用也不同［14－15］，其中里那醇、香葉醇和β-香茅醇共存時其協同作用能使啤酒酒花香氣更加突出［1，6，16－19］。

為進一步探索里那醇、香葉醇和β-香茅醇在啤酒中的作用，本文研究了3 者在不同濃度下的單一作用和協同作用對啤酒香氣質量的影響及它們在發酵過程中的變化規律，為進一步探索優化酒花香氣的合理利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要原料

麥芽:澳麥(中國食品發酵工業研究院);酵母:某啤酒廠家生產用菌種。

1.2 發酵工藝

采用某啤酒廠家下面發酵大生產工藝。

1.3 儀器與試劑

1.3.1 主要儀器

氣相色譜Clarus 600，Perkin Elmer 公司;質譜儀Clarus 600T，Perkin Elmer 公司;低溫恒溫水浴鍋XT5706-5203-BF28-R15C-D31，杭州雪中炭恒溫技術有限公司;磁力攪拌器PC-420D，Corning 公司。

1.3.2 主要試劑

里那醇;香葉醇;α-萜品醇;β-香茅醇;橙花叔醇;乙酸香葉酯;乙酸香茅酯;香葉酸甲酯;內標試劑:2-壬醇(所有試劑均購自Acros 公司和Sigma-Aldrich 公司，純度≥95%)。

1.4 主要分析方法

1.4.1 頂空固相微萃取結合GC/MS 的檢測方法

氣相色譜條件

色譜柱:Elite Wax ETR(30 m ×0.25 mm ×0.5 μm)。載氣:氦氣(純度≥99.999%)，流速:1 mL/min，進樣口溫度:240℃，－0.5 min 前不分流進樣，1 min 后開閥，分流比10 ∶1。柱溫:起始溫度40℃，8℃/min 升至120℃，6℃/min 升至210℃，保持5 min。進樣方式:固相微萃取，萃取頭類型:85 μmPA，解析5 min。

質譜條件

離子源溫度:230℃;傳輸線溫度:230℃;電子轟擊源:70eV，掃描范圍:29 ～300amu。定性采用全掃描模式(SCAN)，定量采用選擇離子掃描模式(SIM)。掃描圖譜如圖1 所示。

圖1 酒花香氣物質的氣相色譜/質譜全離子連續掃描圖譜Fig.1 The continuous scanion current profile of hop aroma components by GC/MS

前處理:稱取3 g NaCl 于20 mL 頂空瓶中，加入除氣啤酒5 mL 和內標(2-壬醇)溶液(樣品中濃度為20 μg/L)，放入磁力攪拌轉，加蓋密封墊和鋁蓋密封。將SPME 針管穿透樣品瓶隔墊，伸入瓶中，推手柄使纖維頭伸出針管，纖維頭置于距離樣品表面約20 mm 的上部空間，在45℃水浴溫度下，以550 r/min攪拌45 min，取出手柄，直接進樣，解析5 min。

1.4.2 感官品評

品評小組由8 位評委組成。

1.5 實驗方法

1.5.1 里那醇、香葉醇和β-香茅醇對啤酒香氣的影響

稱取適量里那醇、香葉醇和β-香茅醇標準品，用無水乙醇溶解制備成一定濃度的單一母液，逐級稀釋后在體積分數為4% 的乙醇溶液中分別配制成50 μg/L、25 μg/L 和12.5 μg/L 三種濃度的里那醇、香葉醇和β-香茅醇溶液。設計實驗并結合感官品評，研究4%乙醇溶液中不同濃度里那醇、香葉醇和β-香茅醇對啤酒香氣質量的影響。

1.5.1.1 不同濃度的里那醇、香葉醇和β-香茅醇單一物質對啤酒香氣特性的影響

在4%乙醇溶液中，分別對里那醇、香葉醇和β-香茅醇單一物質的50 μg/L、25 μg/L 和12.5 μg/L三個濃度進行感官品評，針對花香、水果香、玫瑰香、柑橘味、松脂味和整體香氣強度進行打分，對比分析研究其在不同濃度下的香氣特性。

1.5.1.2 不同濃度的里那醇、香葉醇和β-香茅醇協同作用對啤酒香氣強度的影響

為研究里那醇、香葉醇和β-香茅醇的協同作用對啤酒香氣質量的影響，采用L9(33)正交試驗，實驗設計見表1。

表1 實驗設計因素水平編碼表Table 1 Code table of test factors and levels

1.5.2 里那醇、香葉醇和β-香茅醇在發酵過程中的變化規律

在富含酒花香氣啤酒的實驗研究中作者曾對回旋槽添加酒花與發酵罐添加酒花兩種工藝進行對比［20］，發現發酵罐添加酒花的方式遠比回旋槽添加酒花的方式更有利于啤酒酒花香氣的提高。因此，本文主要研究里那醇、香葉醇和β-香茅醇在發酵過程中的變化規律。

實驗方案:分別配制里那醇、香葉醇和β-香茅醇單一母液1 000 mg/L。取未添加酒花的熟麥汁4L 平均分裝成4 組，分別取3 個母液1mL 至3 組麥汁中(即每種單萜類物質最終濃度為1 000 μg/L)，以添加1 mL 無水乙醇的實驗組為對照進行實驗，其他釀造工藝和條件按正常工藝進行。跟蹤分析發酵液中各物質含量變化情況。

2 結果與分析

2.1 里那醇、香葉醇和β-香茅醇對啤酒香氣的影響

2.1.1 不同濃度里那醇、香葉醇和β-香茅醇單一物質對啤酒香氣特性的影響

分別對50 μg/L、25 μg/L 和12.5 μg/L 的里那醇、香葉醇和β-香茅醇溶液進行品評，針對花香、水果香、玫瑰香、柑橘味、松脂香和整體香氣強度進行打分，結果發現:(1)里那醇濃度為12.5 μg/L 時表現為極淡的玫瑰香味;濃度為25 μg/L 時呈現出明顯的柑橘味，其中夾雜著淡淡的花香和微弱的松脂香，香氣明顯而典型;達到50 μg/L 時則以松脂香為主柑橘味為輔，且香氣較為濃郁。由此可見，隨著里那醇濃度的變化，其在4%乙醇溶液中呈現出來的香氣特性也隨之不同，如圖2 所示。普通啤酒中里那醇濃度低于12.5 μg/L，在復雜的啤酒風味中消費者們無法感受到明顯的酒花香氣。當里那醇濃度達到25 μg/L時，明顯的柑橘味在眾多的啤酒風味中較為典型，這也是消費者能輕易辨識的原因之一。里那醇濃度達到50 μg/L 后，典型的柑橘味減弱較為優雅的松脂香占主導，這也許是一些啤酒中雖然里那醇濃度很高，香氣也很濃郁，但并非呈現出強烈柑橘味的一個重要原因。(2)香葉醇濃度為12.5 μg/L 時以淡淡的柑橘味為主水果香為輔，且香氣輕柔;在25 μg/L 時以水果香為主柑橘味和花香為輔，絲絲香甜;在50 μg/L 時則以花香為主，柑橘味和松脂香為輔，香氣清新淡雅;由此可見，香葉醇的香氣特性也會隨著濃度的變化而改變:隨著濃度的增加柑橘味減弱，水果香增強，此后水果味減弱轉而由花香占主導，如圖3 所示。(3)β-香葉醇濃度為12.5 μg/L 時表現為輕柔的玫瑰香和柑橘味，香氣微弱;在25 μg/L 時顯示出清新的松脂味和淡淡的玫瑰香，香氣清新淡雅;在50 μg/L 時則以玫瑰香為主松脂香為輔，香氣雖清新淡雅卻極易辨識。由此可見，在4%乙醇溶液中β-香葉醇的香氣特性亦會隨著濃度的改變而變化，但主要表現為玫瑰香和松脂香，香氣典型而優雅，如圖4 所示。可見，3 種香氣物質在不同濃度下均會呈現出不同的香氣特性。

2.1.2 不同濃度里那醇、香葉醇和β-香茅醇協同作用對啤酒香氣強度的影響

圖2 4%乙醇溶液中不同濃度里那醇的香氣特性Fig.2 Aroma characteristics of differentconcentrations of linalool in 4% (v/v)ethanol solution

圖3 4%乙醇溶液中不同濃度香葉醇的香氣特性Fig.3 Aromacharacteristics of differentconcentrations of geraniol in 4% (v/v)ethanol solution

圖4 4%(v/v)乙醇溶液中不同濃度β-香茅醇的香氣特性Fig.4 Aroma characteristics of differentconcentrations of β-citronellol in 4% (v/v)ethanol solution

對里那醇、香葉醇和β-香茅醇3 個因素及50 μg/L、25 μg/L 和12.5 μg/L 三個水平進行正交試驗設計并針對整體香氣強度進行打分，如表2。經分析發現:因素A 的極差為0.63 最大，說明因素A 對實驗指標啤酒香氣強度的影響程度最大，因素C 次之，因素B 最弱。因素A 的3 個水平中第3 水平，即12.5 μg/L 對啤酒香氣強度貢獻最大，因素B 的3 個水平中第3 水平，即12.5 μg/L 對啤酒香氣強度貢獻最大，因素C 的三個水平中第二水平，即25 μg/L 對啤酒香氣強度貢獻最大，因此最優方案為A3B3C2，即:里那醇濃度為12.5μg/L，香葉醇濃度為12.5 μg/L，β-香茅醇濃度為25 μg/L 時能使啤酒獲得最大的香氣強度。該實驗說明:在濃度為50 μg/L 以下，單一物質濃度越高的組合并不一定能夠使啤酒獲得越大的香氣強度。

表2 不同濃度里那醇、香葉醇和β-香茅醇混合作用正交試驗設計及結果Table 2 Orthogonal experimental design with different concentrations of linalool，geraniol and β-citronellol and results

2.2 里那醇、香葉醇和β-香茅醇在發酵過程中的變化

跟蹤檢測里那醇、香葉醇和β-香茅醇在發酵中的含量變化發現，里那醇進入發酵過程后含量先減少后有所增加，但總體仍為降低趨勢，損失率為36.6%。隨著發酵的進行，游離的里那醇很快被酵母利用而減少，使得α-萜品醇的含量持續增加。此外產生少量香葉醇，且整個發酵過程中其含量基本保持恒定。里那醇含量在第3 天達到最小值，此后隨著酵母對糖苷鍵的利用釋放出部分與糖苷鍵相連的里那醇而使其含量有所回升，如圖5 所示;香葉醇在發酵過程中含量先減少后緩慢回升，總體為降低趨勢，損失率為45.1%。經過酵母的生物轉化作用β-香茅醇的含量大量增加，其中發酵前5 天β-香茅醇的積累較為緩慢，與此同時產生了少量的乙酸香葉酯，此后β-香茅醇不斷持續增加且在第17 天時達到640.11 μg/L，而產生的少量乙酸香葉酯逐漸轉化為少量的乙酸香茅酯，此外還有微量里那醇產生，如圖6 所示;β-香茅醇在發酵過程中含量先降低后快速回升，但總體仍在降低，損失率為8.1%。隨著發酵的進行酵母利用β-香茅醇主要使得乙酸香茅酯的含量有所增加，在第五天達到最高值20.24 μg/L，此后逐漸消失。其次產生微量香葉醇，且其含量在整個發酵過程中基本保持恒定，如圖7 所示。通過該實驗發現:發酵結束后3 種物質的自身含量均先降低后又回升，也許均因酵母水解糖苷鍵釋放出部分單體物質，也許是酵母自溶釋放出其體內的單體物質，也或許是兩者均有，目前尚未得知。

圖5 1 000 μg/L 里那醇發酵過程的物質及其含量變化情況Fig.5 The changes of 1 000 μg/L linalool during fermentation

圖6 1 000 μg/L 香葉醇發酵過程的物質及其含量變化情況Fig.6 The changes of 1 000 μg/L geraniol during fermentation

圖7 1 000 μg/L β-香茅醇發酵過程的物質及其含量變化情況Fig.7 The changes of 1 000 μg/L β-citronellol during fermentation

結合上述兩方面研究，發現在發酵罐添加酒花時，對已知里那醇、香葉醇含量的酒花，結合發酵過程中的損失率，計算并控制好其用量促使啤酒中里那醇、香葉醇和β-香茅醇的最終含量為12.5 μg/L，12.5 μg/L 和25 μg/L 時，便可達到最合理利用酒花香氣資源的目的。

3 結論

在體積分數為4%的乙醇溶液中，里那醇、香葉醇和β-香茅醇在不同濃度下呈現出來的香氣特性不同:里那醇濃度為12.5 μg/L 時表現為淡淡的玫瑰香味，25 μg/L 時呈現出明顯的柑橘味，其中夾雜著淡淡的花香和微弱的松脂香，50 μg/L 時則以松脂香為主柑橘味為輔;香葉醇濃度為12.5 μg/L 時表現為淡淡的柑橘味，25 μg/L 時以水果香為主柑橘味和花香為輔且絲絲香甜，50 μg/L 時則以花香為主，柑橘味和松脂香為輔，香氣清新淡雅;β-香茅醇濃度為12.5 μg/L 時表現為輕柔的玫瑰香和柑橘味，25 μg/L 時顯示出清新的松脂味和淡淡的玫瑰香，50 μg/L 時則以玫瑰香為主松脂香為輔。將里那醇、香葉醇和β-香茅醇不同濃度混合后發現，里那醇對啤酒香氣強度的影響程度最大，β-香茅醇次之，香葉醇最弱。且當里那醇、香葉醇和β-香茅醇濃度分別為12.5 μg/L，12.5 μg/L 和25 μg/L 時的協同作用能使啤酒獲得最大的香氣強度。該實驗證明在50 μg/L 以下，單一物質濃度越高的組合并不一定促使啤酒獲得越大的香氣強度。

將3 種物質添加到麥汁中進行發酵，跟蹤發酵過程中每種物質的含量變化及新物質生成情況。里那醇、香葉醇和β-香茅醇在發酵初期呈顯著下降，此后略微上升，總體上其損失率分別為36.6%、45.1%和38.1%。發酵過程中3 種物質均會發生復雜的生物化學變化:里那醇主要轉化為α-萜品醇，其次是香葉醇;香葉醇主要產生β-香茅醇，且在第5 天后持續快速增加，其次是乙酸香葉酯;而β-香茅醇則主要轉化成乙酸香茅酯。另外，發酵結束后3 種物質的自身含量均先降低后又回升，也許均因酵母水解糖苷鍵釋放出部分單體物質，也許是酵母自溶釋放出其體內的單體物質，也或許是兩者均有，目前尚未得知。

在發酵罐中添加酒花是提高啤酒酒花香氣的有效措施［20］，在此基礎上結合里那醇、香葉醇和β-香茅醇3 種物質在發酵過程中的變化規律，將其在啤酒中的最終含量分別控制在12.5 μg/L、12.5 μg/L 和25 μg/L 既可使用最少量的啤酒花生產出酒花香氣最豐富的啤酒，達到合理利用酒花香氣資源的目的。此處對里那醇，香葉醇和β-香茅醇發酵過程中變化規律的研究僅為初步探索，今后還需在反應條件，反應機理等方面進行更仔細更深入的研究。

［1］ Kishimoto T，Wanikawa A，Kagami N，et al. Analysis of hop derived terpenoids in beer and evaluation of their behavior using the stir bar-Sorptive extraction method with GC-MS［J］． Journal of Agricultural and Food Chemistry，2005，53 (12):4 701 － 4 707.

［2］ Irwin A. Varietal dependence of hop flavour volatiles in lager［J］． Journal of the Institute of Brewing，1989，95(3):185 －194.

［3］ King A，Dickinson J. Biotransformation of hop aroma terpenoids by ale and lager yeasts ［J］． FEMS Yeast Research，2003(3):53 －62.

［4］ Cocito. C，Gaetano. G，Delfini. C. Rapid extraction of aroma compounds in must and wine by means of ultrasound［J］． Food Chemistry，1995，52(3):311 －320.

［5］ Tressl R，Friese L，Fendesk F. Gas chromatographic-mass spectrometric investigation of hop aroma constituents in beer ［J］． Journal of Agricultural and Food Chemistry，1978，26(6):1 422 －1 426.

［6］ Murakami A，Chicoye E，Goldstein H. Hop flavor constituents in beer by headspace analysis［J］． Journal of the American Society of brewing Chemists，1987，45(1):19 －23.

［7］ Sakuma S，Hayashi S，Kobayashi K. Analytical methods for beer flavor control ［J］． American Society of Brewing Chemists，1991，49(1):1 －3.

［8］ Miedaner H，International B. Gas chromatographic investigations on beer［J］． Brauwelt International，1985 (2):206 －208.

［9］ Fritch H，Brauerei B，Kaltner D，et al. Unlocking the secret behind hop aroma in beer［J］． Brauwelt Intemational，2005，23(1):22 －23.

［10］ Praet T，Opstaele F V，Jaskula-Goiris B，et al. Biotransformations of hop-derived aroma compounds bySaccharomyces cerevisiaeupon fermentation ［J］． Elsevier B V，2012，36(4):125 －132.

［11］ 王志堅. 酒花組成對啤酒質量的影響［J］． 釀酒科技，2005(3):41 －42.

［12］ Park S，Noble A. Monoterpene and monoterpene glycosides in wine aromas［J］． Beer and Wine Production，1993，536:98 －109.

［13］ King A，Dickinson J. Biotransformation of monoterpene alcohols bySaccharomyces cerevisiae，TorulasporadelbrueckiiandKluyveromyceslactis［J］． Yeast，2000(16):499 －506.

［14］ Nickerson G. Hop aroma component profile and the aroma unit［J］． American Society of Brewing Chemists，1992，50(3):77 －81.

［15］ Murakami A，Goldstein H，Navarro A. Investigation of beer flavor by gas chromatography-olfactometry ［J］． American Society of Brewing Chemists，2003，61(1):23－32.

［16］ 王憬，崔巍偉，王莉娜，等. 啤酒中酒花香組分分析方法的研究及其在啤酒酒花香氣質量評定中的應用［J］． 啤酒科技，2007(12):29 －34.

［17］ Kishimoto T，Wanikawa A，Kono K，et al. Comparison of the odor-active compounds in unhopped beer and beers hopped with different hop varieties［J］． Journal of Agricultural and Food Chemistry，2006，54(23):8 855 －8 861.

［18］ TakoiK，Koie K，Itoga Y，et al. Biotransformation of hopderived monoterpene alcohols by lager yeast and their contribution to the flavor of hopped beer［J］． Journal of Agricultural and Food Chemistry，2010，58(8):5 050 －5 058.

［19］ TakoiK，Itoga Y，Koie K，et al. The Contribution of geraniol metabolism to the citrus flavour of beer:synergy of geraniol and β-citronellol under coexistence with Excess Linalool［J］． The Institute of Brewing，2010，116(3):251 －260.

［20］ 全巧玲，江偉，王德良，等. 酒花香氣成分的檢測及富含典型酒花香氣啤酒的試驗研究［J］． 啤酒科技，2013(2):28 －36.