高效液相色譜-串聯飛行時間質譜法測定茶葉中6 種農藥的殘留量

馮永巍，薛慶海，汪振炯

1(無錫市產品質量監督檢驗中心，江蘇 無錫，214101)

2(南京曉莊學院 生物化工和環境工程學院，江蘇 南京，211171)

目前，我國在茶葉生產過程中濫用、超量使用農藥的行為比較普遍，國內市場茶葉的農藥殘留的狀況令人擔憂［1－3］。2012 年初，“國際綠色和平組織“發布了《2012 年茶葉農藥調查報道》，曝光了國內市場上茶葉產品中噻嗪酮、毒死蜱、啶蟲脒、吡蟲啉、樂果、多菌靈等多種農藥的殘留情況。在我國現行的食品安全國家標準中，上述農藥大多沒有規定其在茶葉中的最大殘留量，少數農藥如噻嗪酮雖然規定了最大殘留的限量值10 mg/kg［4］，卻遠遠高于歐盟的限量標準0.05 mg/kg［5］。為了保護消費者的身體健康，加強對上述農藥殘留的跟蹤檢測并在國標中規定合理的殘留限量指標顯得十分迫切和必要。

國內對茶葉中農藥殘留檢測主要應用氣相色譜法、氣質聯用法、高效液相色譜法、液質聯用法等。這些方法不同程度的存在檢測靈敏度低，前處理過程繁冗、復雜耗時長，檢測中容易出現假陽性等缺點。高效液相色譜串聯飛行時間質譜檢測技術具有高通量、高靈敏度，能夠獲得精確質量數和同位素信息等優點，在農殘檢測中有著非常良好的應用前景［6－8］。2003 年美國農業部提出QuEChERS 樣品處理技術［9］，水果、蔬菜均質后的樣品經乙腈(或酸化乙腈)提取，采用萃取鹽鹽析分層后，利用基質分散萃取機理，采用PSA(N-丙基乙二胺)或其他吸附劑與基質中絕大部分干擾物(有機酸、脂肪酸、碳水化合物等)結合，通過離心方式去除，從而達到凈化的目的。在保留高回收率的前提下，極大的提高了樣品前處理的效率。本研究以優化的QuEChERS 方法作為前處理方法，建立一種快速、準確檢測茶葉產品中噻嗪酮、毒死蜱、啶蟲脒、吡蟲啉、樂果、多菌靈等殘留的高效液相色譜串聯飛行時間質譜檢測方法，為茶葉中農藥多殘留篩查提供了一種新的技術選擇。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

安捷倫6530 高效液相色譜串聯型四級桿飛行時間質譜儀;MassHunter 工作站及定性軟件;CT15RT型離心機;Milli-Q Academic 型超純水機。噻嗪酮、毒死蜱、啶蟲脒、吡蟲啉、樂果、多菌靈等標準品購自于農業部環境保護科研檢測所;乙腈、甲酸均為色譜純;乙酸、硫酸鎂化學試劑均為化學純;PSA、GCB 購于上海安普科學儀器有限公司;茶葉樣品均購自當地有機茶場。

1.2 儀器工作條件

色譜柱(STABLE BOND-C18 150 mm ×2.1 mm，1.8 μm);流動相:1%甲酸/水，B:1%甲酸/乙腈;流速:0.3 mL/min;梯度洗脫程序:0 ～12 min，10% ～98%B、12 ～20 min，98% ～10%B;色譜柱溫度:45℃;進樣量:5 μL。

ESI 源;正離子模式;噴嘴電壓500 V;干燥氣溫度和流速:300℃、6 L/min;霧化氣壓力:40Pa;鞘氣溫度325℃，鞘氣流量10 L/min;毛細管電壓:4 000 V;質譜采集范圍為m/z 100 ～500。碎裂電壓:100 V。

1.3 樣品前處理

取茶葉樣品30 g 均質粉碎，準確稱取粉碎的茶葉粉末10 g 于50 mL 離心管中，加入10 mL 的乙酸/乙腈溶液(體積比1∶100)，劇烈震蕩提取1 min，于4 000 r/min 離心10 min。取上清液5 mL，加入到含有150 mg PSA 和45 mg GCB 的15 mL 離心管中，劇烈震蕩1 min，于4 000 r/min 離心10 min，取上清液1 mL，經0.45 μm 微孔有機濾膜過濾，待測。

1.4 檢測限

將系列標準品溶液添加到樣品中，按上述方法提取、進樣分析。以信噪比3∶1 作為檢測限(LOD)。

1.5 回收率與精密度

在空白樣品中分別添加10、20、50 μg/kg 標準品，進行回收率和精密度試驗，每個濃度6 個重復，取平均值計算回收率和標準偏差(RSD)。

2 結果與分析

2.1 定性檢測

2.1.1 精確分子量測定

茶葉中6 種農藥殘留的色譜分離和定性檢測結果見表1。從表1 中所列6 種農藥的保留時間來看，在色譜分離過程中多種農藥實現了基線分離。保留時間是分析物定性確證的重要信息，同時通過色譜分離也最大限度的排除了“共流物”中質量相近物質對分析的干擾。試驗中采用正離子模式電離獲得了理想的響應值，被檢測分子經電離后獲得一個正電荷，形成［M+1］+分子離子。將表1 中所列6 種農藥的理論分子量和測量分子量進行比較，6 種農藥檢測質量偏差均小于5.0 mDa，說明檢測分子量的準確度較高，精確分子量數可以作為被測物質定性鑒別的依據。以農藥吡蟲啉為例，以［M +1］+作為提取離子，從總離子流中提取色譜圖(圖1)。從圖1 中可以看出，在背景復雜的總離子圖中提取吡蟲啉的［M +1］+離子的質荷比為256.061 9，質量差設置為2.5mDa，得到了提取色譜圖，在保留時間7.727 min處的色譜峰峰型良好，并且沒有其他雜質干擾，以峰面積積分可進行進一步的定量分析。

表1 6 種農藥的飛行時間質譜定性檢測結果Table 1 The qualitative detection results of six pesticides by HPLC-TOF MS

圖1 吡蟲啉的總離子流色譜圖和提取離子流色譜圖Fig.1 The total ions chromatogram (TIC)and extraction ions chromatogram(EIC)

2.1.2 同位素測定

飛行時間質譜除了能提供被測物質的精確質量數之外還能提供被檢測物的同位素信息，大多數的農藥分子中都含有N、S、P、Cl、Br 等元素，這些元素與其特定的“A+1”或“A +2”同位素的豐度比值是一個常數，因此特征同位素比例也能夠為農藥殘留的定性確證提供有力的依據。圖2 是農藥吡蟲啉的質譜圖，在質譜圖中可以看到m/z = 256.061 9 和258.069 6的2 個峰，兩峰的質荷比約相差2，豐度比為3∶1，符合37Cl 和39Cl 的同位素比例規律，可以推斷該物質的結構式中含有1 個Cl－，此推斷與吡蟲啉(C10H12N4Cl)的元素組成相吻合。圖3 是毒死蜱(C9H11Cl3NO3PS)的質譜圖，在圖2 中可以看到m/z為349.935 6 和351.933 1 兩個峰，2 個峰的質荷比約相差2，豐度比為1∶1，推斷該物質的分子結構中可能含有3 個Cl－離子，該推斷與毒死蜱的分子組成相符合。可見同位素信息在農藥殘留的定性分析上非常有價值。飛行時間質譜與其他濾過型質譜不同，它采用的全掃描模式可以記錄檢測中的所有信號，這也為農藥的非靶向目標物的檢測提供了一種可能，通過數據采集軟件把滿足一定條件的色譜峰從總的離子流中提取出來，再考察色譜峰的質譜圖里是否含有特征同位素信息，減小非靶向目標物篩查范圍，從而實現農藥殘留非靶向篩查。在新型農藥不斷涌現，濫用農藥行為越來越隱蔽的今天，采用飛行時間質譜進行非靶向篩查，將成為未來農藥殘留檢測的重要手段。

圖2 吡蟲啉的質譜圖Fig.2 The mass spectrogram of imidacloprid

圖3 毒死蜱的質譜圖Fig 3. the mass spectrogram of chlorpyrifos

2.3 定量檢測

茶葉樣本中的基質比較復雜，除了糖類、氨基酸、咖啡因還有大量的酚類物質和色素類物質，基質的存在一方面導致比較高的背景，另一方面在雜質再電離過程中與檢測目標物爭奪電荷，導致信噪比的降低，從而影響定量檢測準確性。因此，在充分提取的基礎上對樣品進行凈化對于飛行時間質譜檢測中十分重要。本研究在經典的QuEChERS 方法的基礎上進行了改進，由于茶葉樣品本身的含水率較低，試驗中省略了MgSO4除水的過程，直接采用酸化乙腈對茶葉樣品中的農藥進行提取。根據茶葉中的特定基質，試驗選擇PSA 作為吸附劑吸附茶葉中的有機酸、酚類和脂肪酸，選擇高比例的GCB(石墨化碳黑)吸附葉綠素和其他非極性的干擾物，對提取液進行凈化處理。茶葉樣品中6 種農藥殘留的定量檢測結果見表2。表2 中顯示，6 種農藥的檢測限不盡相同，其中噻嗪酮的檢測限最低為0.01 μg/kg，毒死蜱的檢測限最高為1 μg/kg。6 種農藥在1 ～50 μg/kg 濃度范圍內，均線性關系良好，相關系數R2在0.995 ～0.999之間;在10、20、50 μg/kg 3 個濃度下的加標回收率在80% ～102%之間;平均標準偏差(RSDs)在4% ～6%之間。

表2 六種農藥的定量檢測結果Table2 The qualitative detection results of six pesticides by HPLC-TOF MS

3 結論

本研究建立了同時檢測茶葉中噻嗪酮、毒死蜱、啶蟲脒、吡蟲啉、樂果、多菌靈等6 種農藥殘留量的高效液相色譜串聯飛行時間質譜方法。本法采用優化的QuEChERS 前處理步驟，操作簡便、快捷，測定結果準確可靠，靈敏度高，能滿足茶葉中多種農藥殘留的定性、定量檢測。

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［4］ GB 2763 －2012. 食品安全國家標準食品中農藥最大殘留限量［S］．

［5］ EC 149/2008 amending Regulation(EC)No 396/2005 of the European Parliament and of the Council by establishing Annexes II，III and IV setting maximum residue levels for products covered by Annex I thereto，Official Journals of European Union L58［S］． 01/03/2008.

［6］ 龔雪蓮. 氣相色譜法在測定茶葉農藥殘留中的應用［J］． 現代農業科技，2007(5):55 －56，58.

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