發酵法制備大豆肽的工藝優化及其抗氧化能力*

楊潔芳，劉會平，俞佳，王淑，王浩

(天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津，300457)

肽(pepetides)是α －氨基酸以肽鍵形式連接而成的化合物，它是蛋白質水解的中間產物［1］，具有優于大豆蛋白的食品功能性和生物活性。工業生產中主要的制備方法是復合酶解法，利用內切酶將大豆蛋白水解成分子量較小的肽，再由外切酶將疏水性氨基酸從多肽鏈的末端切下來。但酶解法產肽率相對較低，成本較高，而且得到的終產品往往帶有明顯的苦味［2］，限制了酶解法在多肽生產中的應用。目前常用的脫苦方法有活性炭吸附［3］，超濾［4］，β-環糊精包埋［5］，蛋白酶優選［6］，但這些方法都有一定的弊端，比如增加生產成本以及必需氨基酸的損失。

發酵法是一種集制備與脫苦于一體的高效方法［7］，肽段在微生物代謝活動中產生的混合酶作用下釋放，同時微生物也借助多肽提高生長代謝及產酶能力，循環協作，效率更高［8］，而且產品的風味、色澤等感官特性均優于酶法水解的產物［9］，增強了其在食品中的應用。同時，固態發酵法具有節水節能，低能耗的優點，有利于現代規模化生產。本實驗通過實驗確定了高產大豆肽的工藝，并對肽粗品進行抗氧化能力的測定，旨在為大豆肽的工業生產和應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要原材料

大豆分離蛋白(蛋白質86.51%)，大豆肽粉(淺黃色粉末，吸濕性強，短肽含量156.05 mg/g)購自北京山松生物制品有限公司。

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtitles)1398:由天津科技大學食品學院菌種保藏室提供。

1.2 化學試劑與培養基

1，1-二苯基-2-苦基苯肼(1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)，Gly-Gly-Tyr-Arg 標準品:美國Sigma公司產品。

菌種計數及傳代培養基:牛肉膏0.5%，蛋白胨1.0%，NaCl 0.5%，pH 7.2，固體時加瓊脂2.0%。121 ℃滅菌15 ～20 min。

種子培養基:牛肉膏0.5%，蛋白胨1.0%，NaCl 0.5%，pH 7.2，121 ℃滅菌15 ～20 min。

1.3 實驗方法

1.3.1 肽含量的測定

取0.1 g 干燥并研磨好的發酵產物，加入2.5 mL蒸餾水，于60 ℃水浴條件下浸提30 min。取等體積的10% TCA 加入到浸提液中，4 000 r/min 離心15 min，去除酸不溶性蛋白和長鏈肽沉淀。取3.0 mL 上清液于1 號試管中，0 號試管加3 mL 蒸餾水做參比，然后向2 支試管中分別加入2.0 mL 雙縮脲試劑，充分混勻，靜置10 min，1 000 r/min 離心10 min，在可見光分光光度計上，調節波長為540 nm，測定吸光度。重復操作3 次。

式中:c—多肽的濃度;n—稀釋倍數;v—多肽液的體積;w—多肽的質量。

1.3.2 平均肽鏈長度的測定［10］

采用甲醛滴定法，在水解度較高時，水解度與平均肽鏈長度關系大約表示為:

1.3.3 粗多肽抗氧化能力的測定

將干燥的發酵產物溶于10 倍水溶液中，于55 ℃水浴鍋中恒溫浸提60 min，將上層溶液先用定性濾紙抽濾，得到較為澄清的肽混合液，再用0.22 μm 微孔濾膜進行微濾，得到粗多肽溶液。將此溶液進行真空旋轉蒸發，得到粗肽濃縮液，再分裝至平皿中進行凍干，并進行抗氧化能力的測定(DPPH·［11］、O2－·［12］、·OH［13］清除能力)。

2 結果與討論

2.1 發酵法制備大豆蛋白活性肽工藝優化

2.1.1 蔗糖添加量對大豆肽的影響

以大豆分離蛋白為基礎培養基，分別添加0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的蔗糖進行單因素實驗。

由圖1 可知，平均鏈長隨著蔗糖添加量的增加先增加后減少，而肽含量先略微增加后顯著下降，過量的碳源不但不能完全被微生物所利用，而且會影響菌種產酶水解蛋白的能力，使短肽水解成單個氨基酸的趨勢增強，而蛋白水解成短肽的趨勢減弱，當蔗糖添加量達到2.0%后，短肽水解成單個氨基酸的程度大于蛋白水解成肽的程度，使得短肽含量和平均鏈長均顯著下降。綜合兩個指標的考慮，選擇蔗糖添加量為1.0%為最優。

圖1 蔗糖添加量對大豆肽的影響Fig.1 Effect of sucrose content on soybean peptides

2.1.2 水分添加量對大豆肽的影響

選擇40%、60%、80%、100%、120%的水分添加量［14］，接種量2.0%，36 ℃發酵培養48 h，進行加水量的單因素實驗。

由圖2 可知，隨著水分添加量的增加，大豆蛋白逐漸被水解成更短的肽鏈，而肽含量先增加后有降低的趨勢，2 個指標均在加入多于60%的水后變化不大，說明水分添加量不足會嚴重影響菌種生長及代謝能力，而水分添加量達到60%以后，短肽水解成單個氨基酸的程度略大于蛋白水解成短肽的程度。水分添加量60%條件下，氧氣含量比較適合菌種的生長和酵解作用且能耗小不易污染，所以選擇水分添加量60%為最佳值進行下面的單因素實驗。

圖2 水分添加量對大豆肽的影響Fig.2 Effect of water content on soybean peptides

2.1.3 接種量對大豆肽的影響

加入確定量的蔗糖和水，選擇1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%的接種量，在36 ℃條件下發酵48 h，進行接種量的單因素實驗。

由圖3 可知，隨著接種量的增加，蛋白逐步被酵解成短肽，在接種3.0%時達到最短，肽含量變化則呈先上升后下降的趨勢，同樣在接種3.0%時達到最大。說明接種量小，過量的碳氮源不能被充分利用，造成浪費。但接種量過大，水分及養分不能滿足細菌的生長代謝，菌種之間也會相互抑制，造成酶解產肽量顯著下降。所以選擇接種量3.0%為最佳的接種量。

圖3 接種量對大豆肽的影響Fig.3 Effect of inoculation dose on soybean peptides

2.1.4 發酵溫度對大豆肽的影響

加入確定量的蔗糖和水，接種3.0%的枯草芽孢桿菌，分別在24、28、32、36、40 ℃條件下發酵48 h，進行發酵溫度的單因素實驗。

由圖4 可知，枯草芽孢桿菌在28 ～36 ℃生長良好，溫度低于28 ℃，菌種生長代謝緩慢，產肽量較小，高于28 ℃后，含肽量逐漸減小。而平均鏈長隨著溫度的升高先減小后增加，在32 ℃時達到最小值。說明32 ℃條件下菌種生長代謝處于最佳狀態，能夠最大程度的產生較短的小肽，超過這一溫度，菌種生長代謝作用受抑制，內切作用大于外切作用。綜合2 個指標考慮，選擇32 ℃為最優條件。

圖4 發酵溫度對大豆肽的影響Fig.4 Effect of incubation temperature on soybean peptides

2.1.5 發酵時間對大豆肽的影響

加入確定量的蔗糖和水，接種確定量的枯草芽孢桿菌，在一定溫度下發酵24、36、48、60、72 h，進行發酵時間的單因素實驗。

由圖5 看出，隨著發酵時間的延長，菌種逐漸將蛋白分解成短肽甚至單個氨基酸，肽含量在36 h 時達到最大。而平均鏈長不斷減小，到48 h 后基本不變，說明時間過長，菌種進入衰亡期，產酶能力下降。綜合兩個指標，選擇發酵36 h 為最佳。以此為依據設計正交實驗。

圖5 發酵時間對大豆肽的影響Fig.5 Effect of incubation time on soybean peptides

2.1.6 優化發酵工藝的正交實驗

經過分析上面單因素實驗結果，設計了5 因素4水平正交實驗，實驗結果見表1。

表1 L16(45)正交實驗設計及結果Table 1 L16(45)orthogonal experimental design and results

根據正交實驗結果，各個因素對肽含量的影響順序依次為:接種量＞蔗糖添加量＞水分添加量＞發酵溫度＞發酵時間。最優條件為:蔗糖添加量0.5%，水分添加量70%，接種量2.0%，32 ℃條件下發酵32 h。進行驗證性實驗，測得短肽含量為252.95 mg/g。

各個因素對平均肽鏈長度的影響順序依次為:水分添加量＞發酵溫度＞蔗糖添加量＞接種量＞發酵時間，最優條件為:蔗糖添加量2.0%，水分添加量80%，接種量3.0%，32 ℃條件下發酵48 h。水分添加量對平均肽鏈長度的影響最顯著，水分既是微生物生長代謝必需的物質，又是酶水解蛋白質的必要條件，水分添加量過低，對菌種的生長代謝和酶的水解作用都不利，但過高的水分又會使氧氣含量下降，不利于菌的生長。進行驗證性實驗，測得平均肽鏈長度為4.0。

表2 方差分析表Table 2 Table of variance analysis (n=5)

綜合2 個指標考慮，以肽含量為終指標時用料更省，發酵周期更短，更利于工業生產需要。

2.2 各樣品的抗氧化能力

向體內補充抗氧化劑，清除過多的自由基或中止體內自由基反應，可防止線粒體腫脹和抑制膜的脂質過氧化反應、蛋白質交連、多糖的降解等的發生，對保護生物膜結構與功能的完整性，抑制自由基誘發的疾病和增強體質以及治療疾病都有重要意義。各樣品的DPPH·、O2－·和·OH 清除率見表3。

表3 樣品DPPH·、O2－·和·OH 清除能力Table 3 DPPH·，O2－· and ·OH clearance capacity of each sample

由表3 看出，市售肽與發酵肽均有一定的DPPH·、O2－·和·OH 清除能力，且發酵肽3 種自由基清除率較市售品分別提高了119.53%，26.02% 和65.56%。說明發酵法制備大豆肽這一工藝更好的激發和保留了其中的抗氧化活性成分，有效提高了肽的自由基清除能力。

3 結論

本試驗以大豆肽含量以及平均肽鏈長度為指標，通過單因素實驗和正交實驗，對發酵法制備大豆肽的工藝進行了優化。確定最優工藝條件:蔗糖添加量0.5%，水分添加量70%，接種量2.0%，32 ℃條件下發酵32 h，此條件下測得短肽含量為252.95 mg/g;蔗糖添加量2.0%，水分添加量80%，接種量3.0%，32 ℃條件下發酵48 h，此條件下測得平均肽鏈長度為4.0。發酵肽的DPPH·，O2－·和·OH 清除率分別為45.18%，55.50%和57.63%，較市售肽分別提高了119.53%，26.02%和65.56%。結果表明，發酵法制備大豆肽這一工藝有效的提高了肽的產率以及樣品的抗氧化能力。

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