豬脂聯素球狀結構域gAd 蛋白在重組乳酸乳球菌中表達條件的優化

楊虹坤，劉靄莎，胡文鋒，李巖，吳同山，王進軍

1(華南農業大學食品學院應用微生物研究室，廣東 廣州，510642) 2(東莞市畜牧科學研究所，廣東 東莞，523320)

脂聯素(adiponectin)是動物脂肪細胞分泌的一種蛋白類細胞因子。研究表明，脂聯素與肥胖、動脈粥樣硬化、胰島素抵抗、Ⅱ型糖尿病，以及機體能量穩態等方面有密切關系［1－4］。脂聯素能夠調控動物和人體的能量穩態、葡萄糖代謝和脂肪代謝，是與脂肪沉積呈負相關的脂肪細胞特異性蛋白。豬脂聯素蛋白由243 個氨基酸組成，一級序列分析包含4 個功能區:前17 個氨基酸組成的信號肽、23 個氨基酸組成的氨基端非螺旋功能區(N 端)、一段22 個膠原重復序列(包含8 個重復Gly-X-Pro 及14 個重復Gly-XY)組成的膠原區和137 個氨基酸組成的羧基端球狀區(C 端)［5］。脂聯素在體內循環中以全長型結構(full-length adiponectin，Ad)和較小的C 端球狀結構域(globular adiponectin，gAd)兩種形式存在［6］。脂聯素羧基端的球狀區是脂聯素蛋白生物活性的關鍵部位，有研究報道該球狀結構域單獨作用具有更強的生物活性［7］。

乳鏈球素表達系統(nisin-control gene expressions，NICE 系統)是一種被廣泛研究和運用的乳酸菌食品級誘導表達系統，常以乳鏈球菌素(nisin)作為目的蛋白表達的誘導劑，而乳鏈球菌素是運用于食品生產加工中的食品級防腐劑。在NICE 系統的調節過程中，組氨酸激酶nisK 作為nisin 的傳感器，nisR蛋白作為反應調節子，激活靶基因的轉錄。nisR 和nisK 組成雙組分調節系統。nisin 存在時，結合到nisK 上，nisK 通過磷酸化激活nisR，被激活的nisR 在nisA 啟動子處誘導nisin 操縱子［8－9］。nisK 和nisR基因已經被分離并整合于適當宿主菌的染色體上，nisA 啟動子也已被分離并位于質粒載體上。當目的基因被克隆到這個啟動子的下游，并被轉化進含有nisR 和nisK 的宿主菌中，這個基因的表達便可以通過nisin 來激活。

目前在國內外對脂聯素的研究中，對于不同的表達載體，脂聯素的表達量不盡相同，張國棟等用大腸桿菌表達系統表達脂聯素，結果重組全長脂聯素占總細胞蛋白的35%，脂聯素球狀結構域占總蛋白的22%［10］。王云龍等在脂聯素原核表達的研究中，其表達量約占菌體總蛋白的30%［11］。Tullin 等在動物細胞和酵母菌表達分別表達人和鼠脂聯素基因時，表達產物經純化后得到的重組鼠脂聯素蛋白含量在10 ～30mg/kg，而人脂聯素蛋白在動物細胞核酵母菌表達量為5 ～15 mg/kg［12］。劉靄莎等在乳酸乳球菌中表達了豬脂聯素球狀結構域基因，通過檢測蛋白相對分子質量約為17kDa［13］，本文在此基礎上進一步研究gAd 基因最佳表達條件，為今后此基因工程菌工業化發酵生產奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

劉靄莎等構建的豬脂聯素球狀區域基因的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)原核表達系統L. lactis NZ9000-gAd［13］。

1.1.2 試劑

M17 肉湯培養基，青島海博生物公司;氯霉素(Cm)、TEMED、SDS，北京普博欣生物公司;nisin，Sigma 公司產品;蛋白質Marker MP102，天根生化科技公司;30%丙烯酰胺，廣州美津生物技術公司。

1.1.3 培養基

表達條件優化試驗培養基:改良的M17G 培養基［14］。

培養基優化試驗培養基:5%乳糖，1%酵母膏，1.5% 大 豆 蛋 白 胨，1mmol/L MgSO4，0.01g/L Na2HPO4［15］，用氯霉素作為抗性選擇性標記，pH 值為7。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化

將－20 ℃保存的重組L. lactis NZ9000-gAd 接種于M17G 培養基(含5 ng/mL 氯霉素)，30 ℃培養48 h。挑取單菌落接種于含5mL M17G(含5ng/mL 氯霉素)液體培養基的試管中，培養12 h。

1.2.2 誘導劑濃度對gAd 蛋白表達的影響

將已活化的菌液接到含M17G(含5ng/mL 氯霉素)液體培養基的試管中，30 ℃培養2.5h 后，加入濃度分別為10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL、60ng/mL 的誘導劑nisin，誘導培養6h，4 ℃離心收集菌體，經溶菌酶作用1h 后煮沸10 min，離心棄上清，用SDS-PAGE 電泳檢測分析，蛋白表達量分析采用BandScan 分析軟件。

1.2.3 誘導后培養溫度對gAd 蛋白表達的影響

接種操作同上，細胞培養2.5h 后，加入終濃度10ng/mL 的誘導劑nisin 后，分別置于20，25，30，35，40，45 ℃的恒溫培養箱中培養6h 后收集菌體，檢測方法同上。

1.2.4 誘導時間點( OD) 對gAd 蛋白表達的影響

接種操作同上，接種后于不同時間測定OD600值，分別當OD600≈0.3，0.4，0.5，0.6，0.7 時，加入終濃度為10 ng/mL 的誘導劑nisin，30 ℃培養6h 后，檢測方法同上。

1.2.5 乳糖濃度對gAd 蛋白表達的影響

按1% 的接種量分別接種于乳糖濃度為4%、5%、6%、7%、8%的培養基中，將pH 值調至7，30 ℃恒溫培養箱中靜置5h 后開始誘導，采用已獲得的最佳誘導條件，用SDS-PAGE 檢測目的蛋白表達情況。

1.2.5 氮源濃度對gAd 蛋白表達的影響

基礎培養基中由于使用非單一氮源，而是酵母膏與大豆蛋白胨的復合氮源，因此在進行氮源篩選前，研究了酵母膏與大豆蛋白的最佳配比，為1∶2(酵母膏∶大豆蛋白胨)。將氮源總濃度設定為2%、3%、4%、5%、6%。培養條件同上。

1.2.6 磷酸鹽濃度對gAd 蛋白表達的影響

將基礎培養基中的Na2HPO4濃度設定為0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%，將pH 值調至7，培養條件同上。

1.2.7 無機鹽濃度對gAd 蛋白表達的影響

將已活化的菌種按1%的接種量分別接種于Mg-SO4濃度為0.01%、0.02%、0.03%、0.04%的基礎培養基中，培養條件同上。

2 結果與分析

2.1 誘導劑濃度對gAd 蛋白表達的影響

結果如圖1 所示，采用BandScan 分析軟件得出gAd 蛋白在nisin 濃度為20ng/mL 時蛋白表達量最高。從20ng/mL 開始隨著誘導劑Nisin 濃度的升高目的蛋白表達量反而降低，說明過高的濃度會抑制蛋白的表達，nisin 是一種天然防腐劑，具有一定的抑菌作用，濃度過高時誘導后菌體量明顯降低。因此可以確定誘導劑nisin 的最佳濃度為20 ng/mL。

圖1 不同誘導劑濃度對蛋白表達影響的SDS-PAGE 分析圖Fig.1 Results of SDS-PAGE electrophoresis for the amount of added nisin

2.2 誘導后培養溫度對gAd 蛋白表達的影響

結果如圖2 所示gAd 蛋白在誘導后培養溫度為25 ℃時表達量最高，從25 ℃開始隨著溫度的升高，蛋白表達量反而降低。誘導后培養溫度是影響蛋白表達量的重要因素之一，若溫度過低菌體生長緩慢，新陳代謝速度也隨之降低，細胞活性降低，不利于細胞合成外源蛋白;若溫度過高，菌體培養后期容易衰老自溶，合成的外源蛋白不穩定。因此可知重組乳酸菌的最佳誘導后的培養溫度為25 ℃。

圖2 不同誘導后培養溫度對蛋白表達影響的SDS-PAGE 分析圖Fig.2 Results of SDS-PAGE electrophoresis for the induction temperature

2.3 誘導時間點對gAd 蛋白表達的影響

結果如圖3 所示，gAd 蛋白在OD600為0.4 時表達量相對較高。菌體密度影響蛋白的表達，一般菌體密度與蛋白表達量成正相關關系。過早表達外源蛋白不利于菌體的生長，影響菌體密度，并且表達外源蛋白對菌體本是一種負載，而且過量表達會引發細胞產生應激反應［16］。由此得出當OD600為0.4 時為最佳的誘導菌體密度。

圖3 不同誘導時間點對蛋白表達影響的SDS-PAGE 分析圖Fig.3 Results of SDS-PAGE electrophoresis for the time point of induction

2.4 乳糖濃度對gAd 蛋白表達的影響

結果如圖4 所示，在乳糖濃度為7% 時gAd 蛋白的表達量最高。乳糖的濃度對細胞生長有很大的影響，濃度過低不利于細胞的生長，菌體得不到足夠的營養生長受到抑制，濃度過高會產生反饋抑制作用，引起菌體異常，對菌體代謝、產物合成及氧的傳遞會產生不良影響［17］，細胞在最適營養環境中正常生長，得到較高的細胞密度，是獲得蛋白高效表達的保障。由此可知脂聯素重組乳酸菌的最佳碳源濃度為7%。

圖4 不同乳糖濃度對蛋白表達影響的SDS-PAGE 分析圖Fig.4 Results of SDS-PAGE electrophoresis for the concentration of lactose

2.5 氮源濃度對gAd 蛋白表達的影響

結果如圖5 所示，在氮源濃度為3%時獲得的gAd 蛋白表達量較高。氮源濃度對菌體生長以及合成蛋白有極顯著影響。如果一次性投入氮源過多，易引起菌體生長過盛而使培養基的營養成分過早耗盡，導致菌體過早衰老而自溶，縮短蛋白合成時間;反之氮源濃度過低，菌體生長和蛋白的合成均停止［18］。由此可確定重組乳酸菌的最佳氮源濃度為3%。

圖5 不同氮源濃度對gAd 蛋白表達影響的SDS-PAGE 分析圖Fig.5 Results of SDS-PAGE electrophoresis for the concentration of nitrogen source

2.6 磷酸鹽(Na2HPO4)濃度對gAd 蛋白表達的影響

結果所圖6 所示，在Na2HPO4濃度為0.25%時的蛋白表達量較高，磷酸鹽的含量影響菌體的生長及基因產物的表達，基質中磷酸鹽的含量影響表達質粒的復制速度［19］。當磷酸鹽含量低時由于不能滿足生長需求，菌體密度過低;當濃度過高時，早期菌體旺盛，導致菌體過早衰老，菌體密度依然不能達到較高值。乳酸菌發酵的終產物主要是乳酸，在同型發酵產酸的過程中，乳酸積累到一定的量，會使pH 值降低，影響其生長環境，抑制菌體的生長［20］。由此可以確定Na2HPO4的最佳濃度為0.25%。

圖6 不同Na2HPO4 濃度對gAd 蛋白表達的SDS-PAGE 分析圖Fig.6 Results of SDS-PAGE electrophoresisfor the concentration of Na2HPO4

2.7 無機鹽(MgSO4)濃度對gAd 蛋白表達的影響

結果如所7 所示，當MgSO4濃度為0.02%時蛋白表達量最高。Mg2+對性細胞活性起到很大作用，是細胞進行新陳代謝時，酶的催化劑，適量的Mg2+能促進細胞的生長，加速各種代謝途徑中酶的催化反應，但是過高的Mg2+濃度會造成細胞對金屬離子中毒，而不利于菌體生長。因此確定脂聯素重組乳酸菌的最適MgSO4濃度為0.02%。

圖7 不同MgSO4 濃度對gAd 蛋白表達影響的SDS-PAGE 分析圖Fig.7 Results of SDS-PAGE electrophoresis for the concentration of MgSO4

2.8 誘導表達條件正交實驗的結果

根據單因素試驗得到的結果選擇三個水平進行正交試驗，試驗結果見表1，極差R 值大小順序為:B(溫度)＞A(誘導劑濃度)＞C(誘導時間點)，較優的誘導條件組合是A3B2C2。因此，最終確定脂聯素重組乳酸乳球菌的最佳誘導條件為:誘導劑nisin 的濃度為30 ng/mL、誘導后培養溫度為25 ℃、誘導時間點為OD600為0.4。

表1 誘導表達條件正交試驗結果及其極差分析Table 1 Results of orthogonal experiment of induction conditions and analysis of its range

2.9 培養基優化的正交實驗結果

根據單因素試驗得到結果選擇3 個水平進行正交試驗，試驗結果見表2，極差的大小順序為:B(氮源濃度)＞A(乳糖濃度)＞D(MgSO4濃度)＞C(Na2HPO4濃度)。所以由正交試驗得出的最佳培養基組合為A2B3C2D2。因此，最終確定脂聯素重組乳酸乳球菌的最佳培養基組分為:乳糖濃度7%、氮源濃度 4%、Na2HPO4濃 度 0.25%、MgSO4濃 度0.02%。

表2 培養基優化正交試驗結果及其極差分析Table 2 Results of orthogonal experiment of cultural medium and analysis of its range

3 結論

重組基因工程菌表達條件的優化，一般都是從誘導條件和營養條件方面進行，誘導劑濃度及誘導時菌體密度會影響外源蛋白的表達水平，菌體密度一般控制在菌體的對數生長期或對數中后期。乳酸乳球菌的最適生長溫度是在30 ℃，而質粒穩定和目的蛋白的誘導溫度大多為25 ℃，因此基因工程菌的發酵過程可分為生長和表達兩個階段，有利于提高細菌的生長密度和重組產物的表達量。要獲得高效表達目的蛋白，培養基各組分的濃度和比例要適當，過量的營養物質反而會抑制菌體的生長，特別是碳源和氮源濃度。本文從以上幾個方面對重組脂聯素乳酸乳球菌進行了優化，最終蛋白表達量達到29.4%，為今后工業化生產脂聯素基因工程菌提供了數據。

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