樹突狀細胞核蛋白1的核定位信號鑒定

陶瑞松，徐忠東，王 偉

（合肥師范學院 生命科學系，安徽 合肥230601）

重性抑郁障礙(major depressive disorder，MDD）,又稱重性抑郁癥，是一種常見的嚴重的精神類疾病，其發病機制尚未明確。根據世界衛生組織的統計，重性抑郁障礙發病呈逐年上升的趨勢，如浙江省的MDD 患病率已達4.3%。[1]該疾病的典型癥狀為長期心境抑郁，對曾經感到有趣的活動喪失興趣，對患者的正常生活造成嚴重影響。[2]在美國型患者自殺幾率約為3.4%，而且近60%的人患有其他心境障礙。因而重性抑郁障礙是一種致殘性的疾病，嚴重影響人們的身體、精神和活動，給家庭和社會造成沉重的負擔。

樹突狀細胞核蛋白1（DCNP1），由244 個氨基酸組成，分子量為27kD,定位于人染色體5q31 區的外顯子，主要在腦和骨骼肌中表達；在成熟的樹突細胞內定位于細胞核的核周。[3，4]由于DCNP1 分子量較小，理論上應該可以自由出入細胞核，因而我們認為DCNP1 分子上應該存在定位于核內的核定位信號序列。近年研究發現DCNP1 蛋白的117 位氨基酸表達的提前終止所形成的突變體會增加MDD 發病的危險，因而認為DCNP1 是MDD 發病的一個潛在候選基因。[5]本研究通過對DCNP1 序列的分析和實驗的方法鑒定DCNP1 的核定位信號序列。

1 材料和方法

1.1 材料

真核表達載體pEGFP-N1 購自Clontech,Mutanbest突變試劑盒為TAKARA 公司產品;Lipofectamine2000、DMEM、胎牛血清購自Invitrogen;倒置熒光顯微鏡觀察亞細胞定位在本校實驗室進行。

1.2 載體的構建

野生型DCNP1 的綠色熒光融合蛋白的構建:以人胚胎腎293 細胞全細胞RNA 抽提物為模板，使用上游引物5’-GAGTCGACACTATGCATTACGGAGCA-3’和下游引物5’-TTGGATCCAACTCAGGCACGTGGGCTG-3’，采用RT-PCR 擴增DCNP1 編碼序列，經BamHⅠ和SalⅠ雙酶切后克隆到綠色熒光蛋白pEGFP-N1 構建成pEGFP-N1-DCNP1。

DCNP1 氨基端突變體（DCNP11-116）的綠色熒光融合蛋白構建：以DCNP1 為模板，使用上游引物5’-GAGTCGACACTATGCATTACGGAGCA-3’，和下游引 物5’ -CTGGATCCTTGCTGCTATGCAGTTC -3’,采用PCR 擴增得到重組的突變體DCNP11-116。經BamHⅠ和SalⅠ雙酶切后克隆到綠色熒光蛋白pEGFP-N1 構建成pEGFP-N1-DCNP11-116。

DCNP1 羧基端突變體（DCNP1117-244）的綠色熒光融合蛋白構建：DCNP1 為模板,使用上游引物5’-GAGTCGACGATGAGAAGGAAGACAGGC-3’和下游引物5’-TTGGATCCAACTCAGGCACGTGGGCTG-3’, 采 用PCR 擴增得到重組的突變體DCNP1117-244。經BamHⅠ和SalⅠ雙酶切后克隆到綠色熒光蛋白pEGFPN1 構建成pEGFP-N1-DCNP11-116。

DCNP1 刪除第117-119 位氨基酸殘基的突變體的綠色熒光融合蛋白的構建：根據TAKARA 公司突變試劑盒說明，以pEGFP-N1-DCNP1 為模板，使用上游引物5’-GCTGCTATGCAGTTCATCCTG-3'和下游引物5’-ACAGGCCAGACCAGGCGGGAG-3' 采用PCR 擴增得到重組的突變體pEGFP-N1-DCNP1Δ117-119。

所有構建的重組質粒都經過上海生工測序驗證，野生型及突變型DCNP1 與GFP 融合蛋白的重組結構示意圖，如圖1。

圖1 野生型及突變型DCNP1 與GFP融合蛋白的重組結構示意圖

1.3 質粒轉染及細胞內熒光表達

用含有10%胎牛血清的DMEM （Invitrogen）培養293FT 細胞過夜，將細胞用Opti-MEM 清洗后轉染質粒。使用Lipofectamine2000 轉染試劑盒在無血清的DMEM 中轉染各種質粒。轉染6h 后換含有10%的胎牛血清的DMEM 的完全培養基。轉染36小時后通過倒置熒光顯微鏡放大40 倍進行觀察。

2 結 果

為了觀察野生型DCNP1 以及各種突變型DCNP1 的亞細胞定位特性，我們構建了pEGFPN1-DCNP1，pEGFP-N1-DCNP11-116，pEGFP-N1-DCNP1117-244和pEGFP-N1-DCNP1Δ117-119。然后將這些質粒在293FT 細胞中分別進行轉染。轉染36h 以后，帶有熒光蛋白標記的細胞通過倒置熒光顯微鏡進行觀察。結果顯示野生型DCNP1 如預期一樣定位于細胞核的核周，然而DCNP11-116喪失了核定位的特性，隨機分布于細胞質和細胞核中；DCNP1117-244還分布與核內；而缺失了第117-119 位氨基酸殘基的DCNP1 突變體同樣喪失了原有的核定位的特性，只分布于細胞質中，如圖2。

圖2 野生型及突變型DCNP1 與綠色熒光蛋白（GFP）重組后的亞細胞定位

3 討 論

細胞核的核孔復合體能夠允許水溶性小分子物質進入或輸出核膜，運輸的物質包括出核的RNA、核糖體以及進核的蛋白質、碳水化合物和信號分子等物質。[6]顯而易見小分子物質可以通過擴散作用通過核孔復合體，而大分子物質可能要被特異的信號序列識別后在核孔蛋白的幫助下出入細胞核。[7,8]核定位信號序列正是這樣一類氨基酸序列，它將蛋白質標記后通過轉運進入核內。因而任何一種帶有核定位信號的蛋白均可以有效地通過核孔復合體進入核內。[9]

DCNP1 蛋白由244 個氨基酸組成，主要分布與核周。在293FT 細胞中DCNP1117-244的分布與DCNP1 基本一致，分布于核內。然而第117-119 位氨基酸殘基缺失的DCNP1 突變體卻喪失了原有的核定位的功能，只存在于細胞質中。甚至DCNP11-116由于117 位之后的氨基酸的缺失導致其在細胞質和細胞核內都有分布。對照DCNP1 蛋白的氨基酸組成發現第117-119 位氨基酸分別是賴氨酸、賴氨酸和精氨酸，而核定位信號通常由一段富含賴氨酸、精氨酸等氨基酸的短肽組成，具有高度通透性，介導蛋白質進入核內。[10]因此我們認為第117-119位氨基酸序列是DCNP1 蛋白的核定位信號序列，其117 位氨基酸翻譯的終止改變了其亞細胞定位。并且117 位氨基酸翻譯的提前終止增加了MDD 發病的風險，所以我們推測DCNP1 細胞定位的改變可能在MDD 發病中有一定的關聯作用。

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