HPLC法測定龍膽瀉肝丸中梔子苷的含量

姚鴻雁 席璐

龍膽瀉肝湯方劑出自清·汪昂《醫方集解》，是由龍膽、梔子、黃芩、澤瀉等十味藥制成，為古今臨床常用方劑，具有清肝膽，利濕熱等功效，主治肝膽實火上擾［1］，對頭暈頭痛、耳鳴耳聾、眼底出血、淋證陰癢、赤白帶下、不孕癥、泄瀉、帶狀皰疹等各病，臨床驗之確有療效［2］。該方的特點為瀉中有補，降中寓升，去邪而不傷正，瀉火而不伐胃［3］。方中龍膽為君，梔子、黃芩為臣。本方臨床應用廣，療效卓著，且劑型較多，而文獻中的含量測定多是測定其君藥成分，如《中國藥典》2005版一部收載了龍膽瀉肝水丸中的龍膽苦苷的含量，由于梔子也是本方的主要藥物，且梔子苷為其主要的藥理活性成分之一，本研究建立的方法可測定梔子苷的含量，方法可靠、快速，可較好地用于控制該類制劑的質量，為院內制劑質量控制提供可靠的檢驗標準。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Shimadzu LC-10ATvp型高效液相色譜儀(自動進樣器SIL-20A，輸液泵LC-10ATvp，檢測器SPD-M10AVP)，工作站CLASS-VP V6.14 SP1;賽多利CP225D電子分析天平(德國);AEL-200電子分析天平(湘儀天平儀器設備有限公司);AP-01P型真空泵(天津奧特賽恩斯儀器有限公司);色譜柱:Agilent XDB-C18 柱(4.6×150 mm 5μm)。

1.2 試藥 梔子苷對照品 (110749-200410，中國藥品生物制品檢定所)，甲醇為色譜純，水為純化水，龍膽瀉肝丸 (自制:批號 SY1001、SY1002、SY1003)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱為 Agilent C18柱(5 m，4.6 mm×250 mm);柱溫為40℃;流動相為甲醇-水(23∶77);體積流量:1.0 ml/min;檢測波長:238nm;進樣量:5 l。

2.2 對照品溶液制備 精密稱取梔子苷對照品適量，加甲醇制成濃度為0.0831 mg/ml的對照品溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備 參考藥典中的方法［4］。因藥典方法中規定超聲提取的條件為功率250W、頻率為33kHz、超聲45 min，但實驗室超聲設備的頻率與之不同，故對超聲時間做一考察。分別選擇超聲35 min、45 min、55 min所制得樣品進行測定指標成分峰面積，分別測定3次，結果顯示，峰面積均數隨超聲時間延長而增大，而通過t檢驗發現，超聲45 min效果較35 min有極顯著性差異(P＜0.01)，而超聲55 min峰面積均數雖較45 min大，但差異沒有顯著性(P＞0.05)。為節省分析時間，故選擇超聲45 min。

取龍膽瀉肝丸，研細，取約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 ml，密塞，稱定重量，超聲處理(功率250W，頻率50KHz)45 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.4 陰性樣品溶液的制備 參考藥典中的方法，按處方量取除梔子外所有藥物，并按供試品溶液制備方法操作，得陰性對照溶液，進樣 5 μl。

2.5 專屬性檢查 以丸劑供試品和陰性對照溶液的HPLC圖譜對比可以看到(見圖1)，陰性對照圖譜中梔子苷峰對應位置處無干擾。

2.6 線性相關考察 精密量取梔子苷對照品溶液1、3、5、7、9 ml分別置10 ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻。分別精密吸取對照品溶液5 l，依次注入液相色譜儀中，按上述色譜條件測定，記錄梔子苷峰面積，以梔子苷峰面積對梔子苷量進行線性回歸，得線性回歸方程:Y=1636850x-8178.6，r=0.9998，表明梔子苷在0.0831～0.7479 g/ml時，質量濃度與峰面積積分值呈良好的線性關系。

圖1 龍膽瀉肝丸中梔子苷的HPLC圖譜

2.7 精密度試驗 取梔子苷對照品溶液，連續進樣5次，每次 5 l。結果峰面積分別為 677891、677968、672102、672987、674067、676024，RSD 為 0.37%。

2.8 穩定性試驗 分別在樣品制備0 h、4 h、8 h、12 h、24 h后測定。測得峰面積的RSD為0.82%，(n=5)。可見供試品溶液中梔子苷在24 h內基本穩定。

2.9 重復性試驗 取供試品溶液，按含量測定方法重復測定6 次。峰面積分別為:372065、372463、374512、376328、373407、376694，RSD 為 0.52%。

2.10 加樣回收試驗 采用加樣回收試驗。取本品，研細，取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入梔子苷對照品溶液20 ml，再精密加入甲醇5 ml，密塞，稱定重量，超聲處理(功率250W，頻率50KHz)45 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續濾液5 ml，用甲醇稀釋至10 ml。進樣10 l測定含量。共操作6次。結果見表1。

表1 加樣回收率試驗結果

2.11 樣品測定 取3批龍膽瀉肝丸按“供試品溶液的制備”項制備供試品溶液，依法測定。結果 0.3424%、0.3395%、0.3411%，RSD為0.43%。

3 討論

3.1 測定波長選擇。梔子苷為環烯醚萜苷，其紫外最大吸收波長為238nm，因此選擇238nm作為測定波長。

3.2 流動相選擇。藥典記載梔子中梔子苷的含量測定中使用了乙腈-水(15∶85)系統，實際操作中對該系統考察發現，其基線不易走平，峰形和基線穩定性較差。用甲醇-水(23∶77)試驗，發現其平衡時間較短，基線平穩，保留時間適中，流動相價格總體上亦較乙腈系統低，且在適當的保留時間內，隨著流動相中有機相的比例減小，龍膽苦苷和梔子苷的分離度有所減小［5］。梔子苷和龍膽苦苷均為其主要的藥理活性成分之一，且二者均為環烯醚萜苷，因此，參照藥典方法最終確定使用正文中的流動相。

3.3 梔子為龍膽瀉肝湯方中的臣藥，測定其中的梔子苷含量具有較重要的代表意義。且復方中藥多個指標的測定不但可以減少分析誤差，更重要的是它可以直接反映藥品的質量。該法簡便、快速、準確，適用于龍膽瀉肝制劑的質量控制，為院內制劑質量控制提供適合可靠的檢驗標準。

［1］ 段富津.方劑學.上海:上海科學技術出版社，1995:82-84.

［2］ 孫文學.龍膽瀉肝湯在臨床上的應用.第十五屆中韓中醫藥學術研討會論文集，2011.

［3］ 謝鳴.方劑學.北京:人民衛生出版社，2002:124-126.

［4］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2005年版一部.北京:化學工業出版社，2005:藥典173.

［5］ 劉瑞新.HPLC同時測定龍膽瀉肝丸中龍膽苦苷和梔子苷的含量.中成藥，2007，29(8):1170-1173.