山茱萸環烯醚萜總苷對晚期糖基化終末產物誘導的腎系膜炎癥反應的調節

郭 潔，張曉雙，劉繼平

(陜西中醫學院藥理教研室，陜西咸陽 712046)

糖尿病腎病是糖尿病常見的微血管并發癥之一，是終末期腎功能衰竭的主要原因。流行病學調查顯示終末期腎臟病的年發病率為3.36%，其中糖尿病引發的慢性腎病占糖尿病患者的一半，而約20%～40%的糖尿病腎病患者進展為終末期腎?。?-2］?，F代病理學研究顯示糖尿病腎病的病理改變為腎小球肥大、細胞外基質積聚、基底膜增厚，導致彌漫性或結節性腎小球硬化和腎功能衰竭［3］。糖尿病腎病的發病機制復雜，其機理尚未完全明白。最新的研究顯示，晚期糖基化終末產物(AGEs)誘導的炎癥反應在糖尿病腎病的發生發展中扮演著重要的角色［4］。AGEs是還原糖與蛋白、脂質或核酸的氨基經過希夫氏堿反應形成的一類化合物，可以激發炎癥反應，造成腎系膜細胞損傷及病變［5］。因此，通過干預AGEs誘導的炎癥反應減輕腎細胞的損傷成為有效的策略。

環烯醚萜總苷為山茱萸一類重要的成分。研究顯示，山茱萸環烯醚萜總苷對糖尿病腎病病變具有保護作用［6］。山茱萸環烯醚萜總苷能通過抑制氧化應激來對抗AGEs誘導的腎系膜損傷作用［7］。除此以外，山茱萸環烯醚萜總苷能不同程度地減輕腎小球系膜增生、基底膜增厚、糖原沉積以及腎小管空泡透明變性等［6］。但是，對AGEs誘導的炎癥反應未見報道，且機制也不明確。因此，本研究對山茱萸環烯醚萜總苷對抗AGEs誘導的炎癥反應活性進行了評估，且探索了可能的作用機制。

1 材料

1.1 藥物和制劑 山茱萸環烯醚萜總苷由實驗室自制，主要包括馬錢苷及莫諾苷等，經HPLC測定分析總苷純度達到 67.4%;IL-6(批號:KGERC003-1)，IL-10(批號:KGERC004-2)，腫瘤壞死因子(TNF-α，批號:KGERC007-1)和單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1，批號:KGERC009-1)ELISA試劑盒購自北京科盈美科技有限公司;牛血清白蛋白，D-葡萄糖，氨基胍購自 Sigma公司;RAGE抗體購自 Sinio Biological Inc.;低糖DMEM培養基(Gibco);胎牛血清(FBS)，杭州四季青。

1.2 儀器 酶標儀(美國 Moleculor Devices，USA);LDZ4-1.2離心機(北京精力離心機有限公司);超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司);164-5051型Western電泳儀(美國Bio-Rad公司);BL310型電子天平(德國Sartorias公司)，壓力蒸汽滅菌器(上海博迅醫療設備廠)。

1.3 細胞及動物 大鼠腎小球系膜細胞株HBZY-1，由武漢細胞生物研究所提供。SPF級昆明種小鼠，雌雄各半，雄性，體質量(18.0±2.0)g，由第四軍醫大學實驗動物中心提供，合格證號SCXK-軍-2011-016。

2 方法

2.1 AGEs的制備 根據文獻的制備方法［7］，將5%牛血清白蛋白與0.5 mol/L的D-葡萄糖溶于0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液PBS(pH=7.2)中，混合液經0.22μm濾膜過濾除菌后，置于無菌條件37℃ 孵育3個月。孵育完畢，將獲得的溶液以透析膜置于0.1 mol/L的PBS溶液中過夜除去未結合的分子，最后再用0.22μm濾膜過濾除菌，4℃下存儲備用。

2.2 細胞培養 大鼠腎小球系膜細胞株HBZY-1細胞懸液接種至25 cm2的聚苯乙烯培養瓶中(GIBCO)，以低糖DMEM培養基(含10%胎牛血清、100 U/mL青/鏈霉素)培養。細胞保持在37℃條件95%空氣/5%CO2的培養箱中，待細胞長至80%～90%融合度時，以0.125%胰酶-0.1%EDTA消化，制備細胞懸液，作進一步實驗用。

2.3 巨噬細胞穿透能力測定 根據已有文獻的試驗方法［8］，將PBS溶液置于4℃冷藏2 h，待完全冷卻，取10 mL PBS注入昆明種小鼠腹腔，迅速脫臼處死，置于75%酒精中浸泡30 s，于超凈臺無菌環境中抽取腹液，置于10 mL離心管中，3000×g離心5 min，將沉淀物以0.83% 氯化銨吹勻，裂解紅細胞，3000×g離心5 min，將剩余的沉淀物以培養基吹勻，計數(1×105個/mL)，接種至24孔Transwell的上室，下室接種HBZY-1系膜細胞(5×105個/mL)，培養基應高于上室膜的高度，保證巨噬細胞的孵育條件，然后共同孵育24 h。待孵育完畢，分別設牛血清白蛋白組(200μg/mL)、AGEs(200μg/mL)組、陽性對照氨基胍(10μmol/L)+AGEs(200μg/mL)、山茱萸環烯醚萜總苷高劑量(1 mg/mL)+AGEs(200μg/mL)、山茱萸環烯醚萜總苷中劑量(0.5 mg/mL)+AGEs(200μg/mL)和山茱萸環烯醚萜總苷低劑量(0.25 mg/mL)+AGEs(200μg/mL)。先給予藥物，間隔30 min后再給予AGEs。孵育24 h后，取出上室，以脫脂棉輕輕擦拭小室的內側，PBS潤洗3次后，以1%結晶紫染色10 min，取出洗去未結合的結晶紫，然后以刀片取膜，以30%冰醋酸溶解，于580 nm波長下測定吸光度值。

2.4 炎癥因子的ELISA測定 在共培養結束后，將細胞的上清液取出，根據試劑盒的說明，測定細胞上清液中的炎癥因子 IL-6、IL-10、MCP-1和TNF-α的分泌水平。在反應完畢后，樣品于振蕩器中震蕩1 min以混勻，然后酶標儀中分別在450 nm條件下測定IL-6，IL-10，MCP-1和 TNF-α樣品的吸光度值。根據對照品標注曲線計算IL-6，IL-10，MCP-1和TNF-α的水平。

2.5 ICAM-1和 TGF-β1蛋白的 Western blot分析將1×106個/mL接種至6孔板中，給藥孵育后，以冰冷的PBS溶液潤洗3次，以細胞裂解液提取蛋白。勻漿轉移至 Ep管中，14000×g離心 15 min，取上清，以lowry法［6］測定上清液中的蛋白濃度。將定量好蛋白量的蛋白提取液(50μg)與蛋白電泳上樣緩沖液混合，煮5 min，然后上樣，以聚丙烯酰胺凝膠電泳10%SDS-PAGE進行分離(濃縮膠80 V恒壓30 min，分離膠100 V恒壓90 min)。完畢取出凝膠，置于轉移緩沖液中平衡15 min。準備濾紙及NC膜，分別置入轉移緩沖液及去離子水中，進行濕電轉移(恒流200 mA通電，電轉移100 min)。NC膜在5%脫脂奶粉封閉液中4℃封閉過夜，棄去封閉液，不洗，依次加ICAM-1(1∶1000)和 TGF-β1(1∶1000)一抗、孵育、洗滌、HRP結合的二抗(1∶5000)、孵育2 h，然后用TBST充分洗膜，漂洗4次，每次10 min。最后以ECL試劑盒按規定方法進行顯影曝光。圖像以Image-Pro plus(version 415，USA)處理并進行定量分析。β-actin作為內參進行比較分析。

3 結果

3.1 山茱萸環烯醚萜總苷對巨噬細胞遷移能力的影響 從圖1可以看出，與牛血清白蛋白對照組相比，模型組細胞在給予AGEs刺激24 h后，紫色結晶明顯增多(P＜0.01)。在先給予陽性對照藥AGEs抑制劑氨基胍，再給予AGEs后，AGEs誘導遷移的巨噬細胞顯著減少(P＜0.01)。與AGEs模型組相比，在先給予各劑量組山茱萸環烯醚萜總苷(1.0、0.5、0.25 mg/mL)后，遷移巨噬細胞均明顯下降(P＜0.05，P＜0.01)。圖2的結果顯示AGEs組的吸光度值為0.29±0.02，而不同山茱萸環烯醚萜總苷給藥組(1.0、0.5、0.25 mg/mL)的吸光度值分別為 0.17±0.02(高)，0.22±0.03(中)，0.27±0.01(低)，相對的抑制率為42.09% ±7.25%，26.44%±10.23%，20.84% ±6.84%，說明山茱萸環烯醚萜總苷具有抑制AGEs誘導的巨噬細胞遷移的作用，并且該抑制作用呈劑量。

圖1 巨噬細胞遷移圖(結晶紫染色，200×)Fig.1 Macrophage migration(crystal violet staining，200×)

圖2 遷移的巨噬細胞吸光度值Fig.2 Absorbance value of migration of macrophages

3.2 山茱萸環烯醚萜總苷對炎癥因子IL-6，IL-10，MCP-1和TNF-α水平的影響 與空白對照200μg/mL牛血清白蛋白組相比，給予200μg/mL AGEs 24 h后，模型組炎癥因子IL-6，IL-10，MCP-1和TNF-α水平均有明顯增加(P＜0.05，P＜0.01)。但是在給予不同劑量山茱萸環烯醚萜總苷(1.0、0.5 mg/mL)后，與模型組相比，高、中劑量給藥組均能劑量依賴性地降低 IL-6、IL-10、MCP-1和TNF-α水平，具有顯著的統計學意義(P＜0.05，P＜0.01)。結果表明，山茱萸環烯醚萜總苷具有減輕AGEs-誘導的炎癥反應，降低炎癥因子的分泌水平，減緩系膜損傷。見表1。

表1 山茱萸環烯醚萜總苷對HBZY-1細胞IL-6，IL-10，MCP-1和TNF-α水平的影響(，n=6)Tab.1 Effect of iridoid glucosides from Corni officinalis Fructus on the levels of IL-6，IL-10，MCP-1 and TNF-α in HBZY-1 cells(，n=6)

表1 山茱萸環烯醚萜總苷對HBZY-1細胞IL-6，IL-10，MCP-1和TNF-α水平的影響(，n=6)Tab.1 Effect of iridoid glucosides from Corni officinalis Fructus on the levels of IL-6，IL-10，MCP-1 and TNF-α in HBZY-1 cells(，n=6)

注:與牛血清蛋白組相比，＊＊P＜0.01;與AGEs組相比，#P＜0.05，##P＜0.01

組 別 IL-6/(ng·L－1) IL-10/(ng·L－1) MCP-1/(ng·L－1) TNF-α/(ng·L－1)1.47±0.17 0.86±0.14 0.44±0.07 1.25±0.17 AGEs組 1.73 ±0.21 ＊＊ 1.13 ±0.08＊＊ 0.69±0.05＊＊ 1.66±0.21＊＊陽性對照氨基胞+AGEs組 1.52±0.16## 0.92±0.12## 0.48±0.13## 1.29±0.25##山茱萸環烯醚萜總皂苷高劑量+AGEs組 1.49±0.09## 0.88±0.10## 0.48±0.04## 1.28±0.14##山茱萸環烯醚萜總皂苷中劑量+AGEs組 1.57±0.15# 0.95±0.07# 0.55±0.11# 1.40±0.22#山茱萸環烯醚萜總皂苷低劑量+AGEs組牛血清蛋白組1.62±0.09 1.06±0.13 0.60±0.09 1.57±0.31

3.3 山茱萸環烯醚萜總苷對促炎癥因子ICAM-1和TGF-β1蛋白表達的影響 Western blot分析結果顯示，與牛血清白蛋白組相比，在給予AGEs刺激后，促炎癥因子ICAM-1和TGF-β1的蛋白表達顯著增加(P＜0.01)。而先給予不同劑量山茱萸環烯醚萜總苷后，再給AGEs后，ICAM-1和TGF-β1的蛋白表達被劑量依賴性地下調(圖3)。與AGEs組相比，具有顯著的統計學差異(P＜0.05，P＜0.01)。統計結果顯示，AGEs模型組ICAM-1的蛋白表達水平為1.54±0.14，而各劑量山茱萸環烯醚萜總皂苷組(1.0、0.5、0.25 mg/mL)的ICAM-1蛋白表達水平分別為0.66±0.03、1.01±0.12、1.28±0.08;對于 TGF-β1，AGEs模型組的蛋白水平為1.59±0.15，不同劑量山茱萸環烯醚萜總苷組的蛋白表達分別為0.73±0.07、0.77±0.11、1.32±0.14。Western blot分析結果表明山茱萸環烯醚萜總苷能下調AGEs誘導的促炎癥因子的蛋白表達，降低炎癥反應。

圖3 ICAM-1和 TGF-β1 的 western blot圖Fig.3 Western blot analysis of ICAM-1 and TGF-β1

對于可能的作用機制，以AGEs受體(RAGE)的特異性抗體來阻斷AGEs的損傷作用。圖3和表2的結果顯示，在先給予5μg/mL的RAGE抗體后，AGEs誘導的炎癥反應被顯著抑制(P＜0.01)。這個結果提示AGEs誘導的炎癥反應至少與RAGE的作用相關，且山茱萸環烯醚萜總苷減輕AGEs的炎癥反應的作用與RAGE抗體的作用機制可能相似。

表2 山茱萸環烯醚萜總苷對 HBZY-1細胞 TGF-β1和ICAM-1蛋白表達的影響(，n=3)Tab.2 Effect of iridoid glucosides from Corni officinalis Fructus on TGF-β1 and ICAM-1 protein expressions(，n=6)

表2 山茱萸環烯醚萜總苷對 HBZY-1細胞 TGF-β1和ICAM-1蛋白表達的影響(，n=3)Tab.2 Effect of iridoid glucosides from Corni officinalis Fructus on TGF-β1 and ICAM-1 protein expressions(，n=6)

注:與牛血清蛋白組相比，＊＊P＜0.01;與AGEs組相比，#P＜0.05;##P＜0.01

ICAM-1牛血清蛋白組組 別 TGF-β10.086±0.025 0.087±0.015 AGEs組 1.547±0.136＊＊ 1.590±0.151＊＊RAGE抗體+AGEs組 0.556±0.087## 0.601±0.045##山茱萸環烯醚萜總皂苷高劑量+AGEs組 0.662±0.030## 0.733±0.071##山茱萸環烯醚萜總皂苷中劑量+AGEs組 1.014±0.117## 0.753±0.116##山茱萸環烯醚萜總皂苷低劑量+AGEs組 1.284±0.080# 1.323±0.141#

4 討論

糖尿病腎病是一種常見的糖尿病微血管并發癥，主要病理特征是基底膜增厚，導致腎小球硬化，當發展到晚期，腎組織被大量破壞，腎的排泄功能出現進行性衰退，體內代謝產物及毒性物質排泄減少，引起體內環境的紊亂，臨床上出現一系列的慢性腎功能衰竭表現，即終末期腎病綜合征［9］。糖尿病腎病的發生發展與多種因素相關，如高血壓、高血糖、肥胖、遺傳等。其中，因高血糖引發的糖代謝紊亂是一個重要的因素。在生物機體內，異常增多的還原糖與體內的蛋白、核酸以及脂質發生非酶糖基化反應，形成一類具有毒性的交聯產物，稱之為晚期糖基化終末產物，即AGEs［10］。異常增多積聚的AGEs與受體結合，觸發級聯信號事件，導致腎小球病理變化。

越來越多研究顯示，AGEs引發的炎癥對糖尿病腎病的發生發展起著不可忽略的作用。Hotamisligil研究發現糖尿病腎病的炎癥是一種慢性低度、代謝引發的炎癥，主要由營養物和代謝過剩所觸發［11］。AGEs可以導致多種促炎癥因子和炎癥因子的表達增加，例如MCP-1、ICAM-1、白細胞介素系列、TGF-β1等。在本研究中發現腎系膜細胞暴露于AGEs能顯著增加炎癥因子的表達。這與以往的研究相一致。

山茱萸環烯醚萜苷是山茱萸中一類重要的活性成分，研究顯示其對糖尿病腎病具有顯著的保護作用。山茱萸環烯醚萜總苷能使系膜細胞的S期細胞減少，上調細胞內SOD和GSH-Px活性，下調ROS和 MDA［7，12］。許慧琴等研究還顯示山茱萸環烯醚萜總苷能減少AGEs在腎皮質的過度沉積，同時亦能顯著抑制RAGE的過高表達［13］。但是，山茱萸環烯醚萜總苷對AGEs誘導的炎癥反應還未見報道。在本實驗的細胞共培養體系中，山茱萸環烯醚萜總苷能顯著抑制巨噬細胞的遷移。山茱萸環烯醚萜總苷抑制AGEs誘導的炎癥因子的釋放，包括IL-6、IL-10、MCP-1和TNF-α。除此之外，山茱萸環烯醚萜總苷還下調AGEs誘導的促炎癥ICAM-1和TGF-β1的蛋白表達。在腎臟組織的病變中，AGEs上調的ICAM-1，可以促使單核巨噬細胞在腎臟組織中浸潤，釋放各種炎性因子如IL-6、IL-10、TGF-β1等，進一步促進炎細胞的浸潤［14］。對于炎癥因子MCP-1，是單核細胞最強的趨化因子。研究發現MCP-1在糖尿病腎病中呈現表達上調，可以調節黏附分子的表達，促使單核細胞浸潤腎組織［15］。

許多研究顯示AGEs和RAGE的相互作用在糖尿病腎病的發生發展中起著重要的作用［16］。AGEs與系膜細胞表面的RAGE結合并活化RAGE，觸發氧化應激反應，導致大量的活性氧和活性氮的生成。氧化應激引發腎系膜細胞內的促炎癥反應，上調炎癥介質的分泌，形成微炎癥環境，最終引起腎系膜細胞的結構和功能的紊亂。在本研究中，以RAGE的特異性抗體阻斷AGEs與RAGE的相互作用來探索山茱萸環烯醚萜總苷可能的作用機制。結果證明RAGE抗體能部分減輕AGEs誘導的炎癥反應，而山茱萸環烯醚萜總苷具有類似的作用。這可能與山茱萸環烯醚萜總苷干預AGEs-RAGE的相互作用有關。但是山茱萸環烯醚萜總苷對抗AGEs誘導的炎癥反應是否是通過此受體作用，仍需進一步的深入研究。

總之，本研究顯示山茱萸環烯醚萜總苷能減輕AGEs誘導的腎系膜細胞的炎癥反應，對糖尿病腎病具有較好的干預作用。這種作用可能是與干預AGEs-RAGE途徑相關。

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