Tricine-SDS-PAGE法對阿膠的酶解物鑒別

付英杰，侯 林，李艷芝，田景振*

(1.濟寧醫學院藥學院，山東日照 276826;2.山東中醫藥大學藥學院，山東濟南 250355)

阿膠為馬科動物驢Equus asinus L.的干燥皮或鮮皮經煎煮、濃縮制成的固體膠。性味甘、平;歸肺、肝、腎經;功能補血止血、滋陰潤燥;主治血虛證;另可作腫瘤的輔助治療［1］。阿膠因加工過程時間長、步驟繁瑣，制作過程中的工藝指標多不量化，所以成分復雜、且水解物結構具有隨機性，質量評價從成分上難以入手。作者研究膠劑時發現動物膠胰蛋白酶水解液的Tricine-SDS-PAGE電泳譜出現多條細條帶。若采用不同酶對動物膠進行水解，由于不同蛋白酶的酶切位點不同，條帶位置具有一定差異。因此，采用不同蛋白酶對膠劑進行酶解，以酶解物為橫坐標，以Tricine-SDS-PAGE譜帶為縱坐標制成的圖譜較傳統的PAGE電泳在質量評價上效果更優。為此，采用上述方法對阿膠進行測試檢驗，考察其條帶變化情況，并與龜甲膠和鹿角膠的圖譜做了比較。

1 實驗材料

1.1 儀器 DYY—Ⅲ2型電泳儀(北京六一儀器廠)，JY—SCZ2型雙垂直電泳槽(北京君意東方電泳設備有限公司)，TS—1型脫色搖床(江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司)，MC02270113移液器(上海求精生化試劑儀器有限公司)，PHS—3CPH計(上海康儀儀器有限公司)。

1.2 試劑

1.2.1 酶 胃蛋白酶(C1 230013;1∶3000)、胰蛋白酶(34547;≥2500 units/mg)、α-糜蛋白酶(D1 205011;800 usp units/mg)、木瓜蛋白酶(38549;≥ 3 units/mg)。

1.2.2 電泳試劑 四甲基乙二胺(TEMED，30850)、丙烯酰胺(D1219036)、甲叉雙丙烯酰胺(Bis，39962)、三羥甲基氨基甲烷(Tris，C1216014)、過硫酸銨(AP，D1205020)、N-三(羥甲基)甲基甘氨酸(Tricine，C1212001)、十二烷基硫酸鈉(SDS，A1203151)、考馬斯亮藍G250(B1216033)。酶及電泳試劑均購自于上海晶純實業有限公司。其他試劑均為分析純。

1.3 藥材 東阿阿膠(山東東阿阿膠股份有限公司，111122);龜甲膠、鹿角膠(散裝)。均購于北京同仁堂日照藥店。

2 方法與結果

2.1 樣品液的制備

2.1.1 預處理方法及分組 在膠劑的純化處理中常采用硫酸銨鹽析法，為了考察鹽析對電泳是否具有影響，設計實驗:稱取東阿阿膠10.9483 g，加200 mL熱水攪拌溶化，分二等份。

A組為鹽析組:將硫酸銨緩慢加入第一份樣品液至30%飽和度，采用脫脂棉過濾除去其中的脂及脂蛋白，于濾液中繼續補加硫酸銨至90% 飽和度，移至離心管中，于3000 r/min轉速下離心20 min。離心后不溶物浮于液面上，傾去液體，將不溶物移至大燒杯中，加蒸餾水定容至500 mL。

B組為普通組:直接采用脫脂棉過濾，加蒸餾水定容至500 mL。

由于酶也為蛋白質，為了考察各種酶是否對電泳圖譜存在干擾，另設計了分組。

C組為樣品空白組:500mL蒸餾水。

D組為酶空白組:樣品液中不加酶，但溫度、時間與酶解條件一致。

2.1.2 酶解 將2.1.1項所得樣品溶液，每次量取100 mL，按表1所示方法進行酶解，溫度為37℃，酶解時間為2 h，酶解結束后冷卻，再于85℃下滅活15 min(木瓜蛋白酶滅活溫度為95℃)。

表1 樣品液酶解方法及實驗分組Tab.1 Enzymolysis methods of samples and the experiment groups

2.2 電泳 由于所得酶解液分子量較小，采用普通的SDS-PAGE難以分開，故采用小分子蛋白電泳(Tricine-SDS-PAGE)，該方法能區分1 kD～10 kD的小分子肽。參考相關文獻［2-9］，結合預實驗，采用改良的Tricine-SDS-PAGE法，與文獻法有較多不同之處。

2.2.1 各儲存液的配制

2.2.1.1 Low Bis的配制 稱取丙烯酰胺48.0 g、甲叉雙丙烯酰胺(Bis)1.5 g，加H2O至100 mL，4℃保存。

2.2.1.2 凝膠緩沖液的配制 稱取十二烷基硫酸鈉(SDS)0.3 g、三羥甲基氨基甲烷(Tris)36.4 g加H2O至100 mL，加HCl調pH至8.45。

2.2.1.3 陽極緩沖液的配制 稱取Tris 12.11 g，加H2O至500 mL，加HCl調pH至8.9。

2.2.1.4 陰極緩沖液的配制 稱取Tris 6.06 g、N-三(羥甲基)甲基甘氨酸(Tricine)8.96 g、SDS 0.5 g，加H2O至500 mL。

2.2.1.5 8×Tris.HCl/SDS的配制 稱取 Tris 6.05 g、SDS 0.4 g，加H2O至100 mL，加HCl調pH 6.8。

2.2.1.6 樣品緩沖液的配制 取8×Tris.HCl/SDS 2 mL，加入甘油4.8 mL，SDS 1.6 g，考馬斯亮藍G2504 mg，加H2O至10 mL，臨用時加熱。

2.2.1.7 考馬斯亮藍G250染色液的配制 稱取4 mg考馬斯亮藍G250，加H2O至10 mL。

2.2.2 各工作液的配制

2.2.2.1 分離膠液的配制 依次加入Low Bis 1800μL，凝膠緩沖液 3000μL，甘油 640μL，H2O 920μL。

2.2.2.2 10%過硫酸銨(AP)的配制 稱取1.0 g AP，加H2O至10 mL，現用現配。

2.2.2.3 12.5%四甲基乙二胺(TEMED)的配制量取 100μL TEMED，加入 700μL H2O 中，置于EP管中，現用現配。

2.2.3 凝膠的制備

2.2.3.1 分離膠的配比 于5.6 mL分離膠液中加入 10%AP168μL 和 12.5%TEMED 56μL。

2.2.3.2 間隔膠的配比 610μL Low Bis、1.5 mL凝膠緩沖液、890μL H2O并依次加入10%AP 80μL 和 12.5%TEMED 30μL。

2.2.3.3 堆積膠的灌制 100μL Low Bis、465μL凝膠緩沖液、685μL H2O并依次加入10%AP 37.5μL，12.5%TEMED 12.5μL，當液面到達頂端時插入樣品梳，放置30 min。

2.2.4 電泳 小心地拔出堆積膠中的樣品梳，將凝膠放入電泳槽中，用微量注射器將樣品液加入到樣品槽中。將電極插頭與適當的電極相連，穩定電壓30 V 1 h至堆積膠結束，電壓增至100 V至分離結束，停止電泳，拔掉電極插頭，從電泳槽中取出凝膠玻璃板，輕輕從一角撬開玻璃板取出凝膠準備染色。

2.2.5 染色與脫色 戴上PE手套以免將指印留在凝膠上，將凝膠移入平皿中。實驗中發現采用普通考馬斯亮藍G250染色法難以清楚染色，通過預實驗，采用銀染法。

銀染色方法［10］:加入5倍體積的30%乙醇、10%乙酸，振搖30 min，溫育過夜;去除乙醇、乙酸;加入5倍體積的30%乙醇，振搖30 min，反復幾次;去除乙醇，加入10倍體積的H2O，振搖10 min，反復幾次;去除水，加入 5倍體積的0.1%AgNO3，振搖30 min;去除硝酸銀，用H2O清洗20s;加入5倍體積的2.5%NaCO3、0.02%HCHO，振搖至背景變黑;加入1%乙酸停止反應;加H2O清洗，振搖10 min;若不清晰可反復2次。

2.2.6 阿膠酶解物條帶結果 如圖1，A組、D組、C3組、C4組條帶均連接成片，且A組在間隔膠區壓縮速度極慢，效果差，B組與C組相互比較的條帶位置見表2。

2.2.7 對比試驗 稱取東阿阿膠、鹿角膠、龜板膠各10.9483 g、10.4572 g、10.9872 g，分別用200 mL熱水攪拌溶化。每份膠液均4等分，分別采用胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、糜蛋白酶、胰蛋白酶，按2.1.2項下方法、表1普通組酶解條件進行酶解。電泳后結果見圖2、表3。

圖1 阿膠酶解電泳條帶示意圖Fig.1 Diagrammatic sketch of electrophoresis strip from enzymatic degradation products of E'jiao

表2 阿膠酶解條帶位置Tab.2 Strip position of the enzymatic degradation products from E'jiao

圖2 不同膠劑酶解電泳條帶示意圖Fig.2 Diagrammatic sketch of electrophoresis strip from enzymatic degradation products of different Chinese medicine gelatin

表3 不同膠劑酶解條帶位置Tab.3 Strip position of the enzymatic degradation products from different Chinese medicine gelatin

3 小結與討論

3.1 關于硫酸銨鹽析的影響 硫酸銨可通過鹽析作用除去阿膠中雜蛋白，但其電荷與蛋白質分子表面電荷和SDS電荷中和，使蛋白質表面電荷數降低，使電泳速度減慢。在試驗中發現條帶效果差，因此排除硫酸銨純化法，僅采用脫脂棉過濾即可，使方法得到簡化。

3.2 關于酶的影響 樣品空白組(C組)中，除木瓜蛋白酶組有干擾外，其他三組均不相同，說明胃蛋白酶、糜蛋白酶、胰蛋白酶不影響樣品蛋白條帶。

由酶空白組(D組)得到的結論是:阿膠溶液如不經過酶解，其分子量是一個大的范圍;而經過酶解后，不同的酶解物，其電泳條帶不同。

在表3中可看到木瓜蛋白酶所得阿膠結果與表2有較大差異，重復性不好。由于木瓜蛋白酶選擇性地切斷L-精氨酸、L-賴氨酸、甘氨酸和L-瓜氨酸殘基羧基參與形成的肽鍵，可能對蛋白條帶的影響隨機性較大，因此并不建議使用木瓜蛋白酶。但圖2顯示可使鹿角膠有大量條帶產生，因而該酶的使用有待進一步考察。

3.3 電泳中由于加入了SDS，使酶解物條帶位置僅與分子量有關，近年就有文獻利用Tricine-SDSPAGE法對分子量進行研究［11-12］。

同種酶水解不同的膠劑時，因不同膠本身氨基酸排列順序不同，所以即使酶切位點相同，酶解后的蛋白質片段差異依然較大，分子量不同，所以條帶明顯不同。

3.4 本實驗采用四種酶對阿膠進行酶解，取酶解物進行Tricine-SDS-PAGE(小分子蛋白電泳)，為阿膠等中藥膠劑的定性鑒別提供新思路。

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