解除附件扭轉對兔卵巢組織MDA、GSH-Px和CAT的影響

于月新，李巨，陳佳，樊寶劍，顏宇博

附件扭轉(adnexal torsion，AT)是婦科常見的急腹癥之一，主要由缺血和保留卵巢術后的再灌注損傷引起。扭轉發(fā)生后，卵巢靜脈和動脈血流依次受阻，導致卵巢組織發(fā)生充血、水腫及缺血性損傷，產(chǎn)生大量氧自由基，導致蛋白質降解、核酸斷裂、線粒體變性、崩解，最終造成細胞死亡。本研究觀察附件扭轉后再灌注對家兔卵巢谷胱甘肽-過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)活性及丙二醛(MDA)含量的影響，以期為臨床治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及設備 GSH-Px、CAT、MDA生化檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。HERAEUS Pico 17離心機(德國Thermo公司)；UV-1700 Pharmaspec紫外分光光度計(美國Shimadzu公司)。

1.2 實驗動物及分組 雌性成年日本大耳白兔40只，8～12月齡，體重2.5～3.0kg，由沈陽軍區(qū)總醫(yī)院實驗動物中心提供[合格證號：SCXK(軍)2007-001]。隨機分為實驗組(n=32)和對照組(n=8)。實驗組附件扭轉24h后解除扭轉，再按隨機排列表法分成4組，每組8只，分別于再灌注24、48、72、96h后取雙側卵巢組織，以右側卵巢作為內(nèi)對照。動物采用籠中獨立飼養(yǎng)方法，自由飲食，適應性飼養(yǎng)1周后進行實驗。

1.3 附件扭轉模型制作 實驗兔稱重后以氯胺酮40mg/kg肌內(nèi)注射，待四肢松軟、睫毛反射消失后將其仰臥固定于手術臺。取下腹部正中長約6cm切口，逐層切開入腹腔，暴露雙側子宮和輸卵管、卵巢，觀察并記錄其大小及顏色。將實驗組兔左側附件按順時針方向旋轉3周，并固定于左側腹壁，卵巢1min后由灰白變成紅色表明扭轉成功。24h后解除扭轉，分別于再灌注24、48、72、96h后取雙側卵巢組織。對照組僅開腹后提拉出左側附件至切口，再放回原處關腹，96h后取雙側卵巢組織。

1.4 MDA、GSH-Px與CAT測定 將取出的卵巢組織置于–80℃保存，收集標本后按南京建成生物工程研究所提供的檢測試劑盒說明書分別測定卵巢組織中MDA、GSH-Px、CAT的活性或含量，其中GSH-Px活性檢測采用DTNB法，CAT活性檢測采用可見光法，MDA含量檢測采用硫代巴比妥酸法。

1.5 統(tǒng)計學處理 計量資料以x±s表示，采用SPSS 11.5軟件進行單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 術后一般情況 40只兔均存活，實驗組附件扭轉24h后可見腹腔內(nèi)程度不等粘連，子宮及右附件未見明顯異常，左側卵巢及輸卵管水腫、充血，呈紫色或紫黑色。對照組及實驗組各組肛溫、心率、呼吸頻率比較無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

2.2 再灌注后各組兔卵巢及輸卵管肉眼所見 附件扭轉24h后解除扭轉，再灌注24h后卵巢及輸卵管顏色5只呈紫色，2只呈淺紅色，而48h后1只呈紫色，3只呈淺紅色，72h時4只呈淺紅色，2只顏色恢復正常，96h后8只顏色全部恢復正常。

2.3 GSH-Px活性檢測 附件扭轉解除后24h至72h，實驗組左側卵巢GSH-Px活力與對照組比較明顯下降(P＜0.01)，96h后與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05，表1)。

2.4 MDA含量檢測 附件扭轉解除后24h及48h，與對照組、實驗組右側卵巢比較，實驗組左側卵巢MDA含量明顯上升(P＜0.01)，72h后開始下降，96h后與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05，表1)。

表1 兔卵巢GSH-Px、CAT活性及MDA含量比較(n=8)Tab.1 Comparison of GSH-Px, CAT activity and MDA level in ovaries of rabbits n=8)

表1 兔卵巢GSH-Px、CAT活性及MDA含量比較(n=8)Tab.1 Comparison of GSH-Px, CAT activity and MDA level in ovaries of rabbits n=8)

Item Control group Study group Left ovary Right ovary GSH-Px(U/ml)24h 197.73±9.85(1) 0.429±0.214 48h 163.71±11.07(1)0.531±0.381 72h 291.56±18.67(1)(2)0.324±0.257 96h 382.31±16.95 368.79±17.67(4)0.562±0.471 CAT(U/ml)24h 36.63±1.02(1)(5)75.34±1.87 48h 25.63±0.88(1)(3)(5)72.42±1.39 72h 71.69±1.82(2) 69.79±1.83 96h 78.69±1.82 96.55±1.89(1)(4)73.63±1.31(1)P＜0.01 compared with control group; (2)P＜0.05 compared with 48h; (3)P＜0.01 compared with 24h; (4)P＜0.05 compared with 72h; (5)P＜0.01 compared with right ovary

2.5 CAT活性檢測 附件扭轉解除后24h及48h，與對照組、實驗組右側卵巢比較，實驗組左側卵巢CAT活力明顯下降(P＜0.01)，而實驗組右側卵巢與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。72h后，實驗組左側卵巢CAT開始升高，但與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，96h后與對照組比較明顯升高(P＜0.05，表1)。

3 討 論

AT是婦科急診手術的第五大常見病因，扭轉的發(fā)生常牽涉卵巢損傷和不育，對扭轉的卵巢進行保守性處理非常棘手[1-2]。有研究表明，附件缺血-出血性的藍黑色外觀是靜脈、淋巴淤滯的結果，但不是壞疽[3]，附件扭轉后卵巢靜脈內(nèi)的血液回流首先受阻，卵巢血供減少或停止可能導致機體氧化應激和抗氧化防御體系的失衡，因此卵巢扭轉-扭轉復位造成的損傷類似于其他器官的缺血再灌注損傷[4]。

內(nèi)源性抗氧化酶包括GSH-Px、CAT等，是組織抗氧化應激的敏感指示劑，作為機體重要的抗氧化系統(tǒng)它決定了機體對抗氧化損傷的能力[5-6]。因此在缺血/再灌注過程中，通過檢測GSH-Px、CAT的活力可以反映機體缺血再灌注損傷的程度。MDA是脂質過氧化產(chǎn)物的一種，其含量可反映機體脂質過氧化程度，進而判斷細胞損傷的程度[7]。測定附件扭轉后卵巢組織中GSH-Px、CAT的活性以及MDA的含量可推測體內(nèi)自由基代謝的情況。

本研究發(fā)現(xiàn)，實驗組右側卵巢與對照組卵巢組織相比，GSH-Px、CAT、MDA活性無明顯變化，而實驗組左側卵巢再灌注24h后MDA開始升高，48h達高峰，72h開始下降，96h接近正常。附件扭轉解除后24h至72h，實驗組左側卵巢GSH-Px活力明顯下降，96h后恢復正常。實驗組左側卵巢附件扭轉解除后24h及48h，CAT活力明顯下降，72h后開始升高，96h后達高峰。表明附件扭轉后卵巢組織缺氧，解除扭轉后卵巢因再灌注損傷產(chǎn)生大量氧自由基，MDA含量顯著增多，從而破壞卵巢細胞。而GSH-Px、CAT含量于48h下降，顯示再灌注早期卵巢抗氧化應激能力損傷。

本研究還發(fā)現(xiàn)，附件扭轉24h后解除扭轉，再灌注24h后卵巢及輸卵管顏色5只呈紫色，2只呈淺紅色，隨時間進展，卵巢及輸卵管顏色逐漸變淺，96h后8只顏色全部恢復正常，而卵巢組織中的GSH-Px、CAT活性于再灌注24h后明顯降低，隨時間進展，48h組下降達低谷，72h有所上升，96h后基本恢復正常。可見附件扭轉后解除扭轉對卵巢造成了明顯的再灌注損傷，以48h時最為顯著，隨時間延長，損傷逐漸減輕，表明再灌注后早期卵巢產(chǎn)生了氧化應激損傷，隨時間進展，損傷逐漸減輕，卵巢經(jīng)歷了再灌注損傷的恢復過程，這可能與扭轉解除后血供逐漸恢復，由局部產(chǎn)生的GSH-Px、CAT逐漸恢復或升高、MDA逐漸清除有關。因此，附件蒂扭轉發(fā)生后如能及時手術，卵巢的缺血再灌注損傷是暫時的。

[1]Chen M, Chen CD, Yang YS. Torsion of the previously normal uterine adnexa. Evaluation of the correlation between the pathological changes and the clinical characteristics[J]. Acta Obstet Gynecol Scand, 2001, 80(1): 58-61.

[2]Kaakaji Y, Nghiem HV, Nodell C, et al. Sonography of obstetric and gynecologic emergencies: part II, gynecologic emergencies[J]. Am J Roentgenol, 2000, 174(3): 651-656.

[3]Oelsner G, Shashar D. Adnexial torsion[J]. Clin Obstet Gynecol,2006, 49(3): 459-463.

[4]Malamas FM, Michala L, Chatzipapas IK, et al. Adnexial torsion:don't give up on the ovary[J]. J Obstet Gynaecol, 2012, 32(3):314-315.

[5]Kumari Naga K, Panigrahi M, Prakash Babu P. Changes in endogenous antioxidant enzymes during cerebral ischemia and reperfusion[J]. N eurol Res, 2007, 29(8): 877-883.

[6]Wang P, Liang XH, Liu ZS, et al. Effects of Vitamin E on oxidative stress induced by intravenous iron supplementa tion in per itoneal dialysis patients[J]. Chin J Pract Intern Med, 2010,30(9): 817-819. [王沛, 梁獻慧, 劉章鎖, 等. 維生素E干預靜脈鐵劑誘導腹膜透析患者氧化應激的研究[J]. 中國實用內(nèi)科雜志, 2010, 30(9): 817-819.]

[7]Tang X, Chen XM, Jiang SS, et al. Effect of telmisartan on oxidative stress in type 1 diabetic rats[J]. Med J Chin PLA,2010, 35(7): 788-791. [唐香, 程訓民, 江時森, 等. 替米沙坦對1型糖尿病大鼠氧化應激的影響[J]. 解放軍醫(yī)學雜志, 2010,35(7): 788-791.]