麥冬提取物的降糖作用及其抗胰島素抵抗的機制研究

寧萌，潘亮，謝文利，金鑫

2型糖尿病(T2DM)占糖尿病患者的90%[1]，胰島功能衰退和胰島素抵抗(insulin resistance，IR)是其病理生理學基礎。目前，T2DM的治療主要是通過促進β細胞分泌胰島素或改善靶組織對胰島素的敏感性進行的，常用藥物包括胰島素及其類似物、磺酰脲類、雙胍類、噻唑烷二酮和抗糖尿病中藥類等。麥冬為一種常用滋陰中藥，藥理作用廣泛，臨床上用于糖尿病輔助治療效果顯著，還可降低糖尿病模型動物的血糖[2]。但文獻報道多為復方制劑或粗提物，成分復雜，具體藥物成分不清且作用機制不詳。本研究選擇麥冬的主要成分麥冬多糖(ophiopogonpolysaccharide，OPSR)和麥冬皂苷(ophiopogonin，OPG)為研究對象，以3T3-L1誘導的脂肪細胞建立葡萄糖消耗模型，初步篩選出具有降糖和增加胰島素敏感性的提取物，觀察其對脂肪細胞瘦素、脂聯素、抵抗素表達水平的影響，探討胰島素增敏相關機制，并應用T2DM模型大鼠進一步驗證其治療效果。

1 材料與方法

1.1 主要材料 3T3-L1前脂肪細胞由同濟大學提供。雄性Wistar大鼠，190±10g，由軍事醫學科學院動物中心提供，動物合格證號SCXK-(軍)-2007-004。OPSR(平均分子量5600，純度90%)、OPG(純度90%)由本實驗室提取。葡萄糖測定試劑盒購自中生北控生物科技股份有限公司。鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)、胰島素(insulin，INS)、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX)為美國Sigma公司產品。DMEM高糖培養基為美國Invitrogen公司產品，瘦素抗體、脂聯素抗體、抵抗素抗體、β-actin抗體為美國Abcam公司產品。

1.2 3T3-L1脂肪細胞的誘導分化及鑒定 參照文獻[3]的方法進行。3T3-L1前脂肪細胞用含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、0.1mg/ml鏈霉素的DMEM完全培養液在37℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養，待細胞融合時，更換培養基為含有終濃度10μg/ml INS、1μmol/L地塞米松和0.5mmol/L IBMX的DMEM培養液，培養48h，更換含10μg/ml INS的DMEM培養液繼續培養48h，最后以DMEM完全培養液繼續培養6d。3T3-Ll細胞誘導分化10d后，加入油紅O染液，30min后于顯微鏡下觀察。

1.3 葡萄糖消耗脂肪細胞模型的建立及麥冬提取物的篩選 將分化良好的脂肪細胞分為空白對照組，陽性對照INS組(10mg/L)，OPSR組(50、5、0.5mg/L)、OPG組(50、5、0.5mg/L)，OPSR(50、5、0.5mg/L)+INS組(10mg/L)，OPG(50、5、0.5mg/L)+INS組(10mg/L)，共13組，每組設3個復孔。按每孔200μl的量加入含提取物培養基，48h后，吸取細胞培養上清150μl，用葡萄糖檢測試劑盒測定培養液中葡萄糖的濃度，計算INS和樣品葡萄糖消耗率，用葡萄糖消耗比值計算樣品的降糖活性。葡萄糖消耗率(%)=(空白孔葡萄糖濃度－給藥孔葡萄糖濃度)/空白孔葡萄糖濃度×100%；葡萄糖消耗比值(%)=(樣品孔葡萄糖消耗率/INS孔葡萄糖消耗率)×100%。

1.4 Western blotting檢測OPSR對IR脂肪細胞瘦素、脂聯素、抵抗素蛋白表達的影響 將分化好的3T3-L1脂肪細胞接種在培養瓶中，加入含1μmol/L地塞米松培養液，溫育48h后構建脂肪細胞IR模型[4]。將細胞分為模型對照組，陽性對照羅格列酮(rosiglitazone，RTZ，1×10－6mol/L)組，OPSR低、中、高濃度(1×10－7、1×10－6、1×10－5mol/L)組。加入含OPSR培養液，孵育48h，然后加入INS，使其終濃度為100nmol/L，繼續孵育30min。提取各組細胞總蛋白，BCA法蛋白定量，SDSPAGE電泳，經轉膜、洗膜、封閉后，在封閉袋中分別加入瘦素、脂聯素、抵抗素、β-actin一抗，4℃過夜，漂洗后加入HRP標記的二抗，室溫孵育2h，漂洗后ECL發光、顯影、定影。以目的蛋白條帶與內參條帶灰度值的比值作為指標，再將此指標與模型對照組作對比(Folds of control)，比較各組之間相對蛋白表達量的差異。

1.5 大鼠T2DM模型的建立及OPSR的治療作用檢測 參照文獻[5]方法建立大鼠T2DM模型。大鼠喂以高糖高脂飼料(飼料組成：10%豬油，20%蔗糖，2.5%膽固醇，1%膽酸鹽，66.5%常規飼料)，以誘導出IR。高糖高脂飲食1個月后，模型組腹腔注射25mg/kg STZ，對照組僅注射枸櫞酸緩沖液，STZ注射1周后，測定空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)和空腹胰島素(fasting insulin，FINs)，計算胰島素抵抗穩態評估模型(homeostasis model assessment of insulin resistance，HOMA-IR)，用以評價外周胰島素的抵抗程度。HOMA-IR=(FBG×FINs)/22.5[6]。將符合標準(FBG大于140mg/dl，胰島素敏感性降低)的大鼠確定為T2DM大鼠。將50只T2DM大鼠隨機分為模型組、RTZ(2mg/kg)組及OPSR高、中、低劑量(200、100、50mg/kg)組。另選擇10只正常大鼠為作正常對照組。給予OPSR和RTZ灌胃，1次/d，模型組和正常對照組給予生理鹽水，連續4周后，測定體重(body weight，BW)及外周血FBG、FINs、甘油三酯(triglyeride，TG)水平。

1.6 統計學處理 應用SPSS 13.0軟件進行分析，數據以表示，多組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 3T3-Ll脂肪細胞誘導分化及油紅O染色鑒定3T3-Ll前脂肪細胞在誘導分化前表現為成纖維細胞樣，胞質中無脂滴，誘導分化10d后，前脂肪細胞變圓、變亮，細胞質中可見大量脂肪滴聚集，經油紅O染色后呈鮮紅色，視野中90%以上3T3-Ll細胞呈這種脂肪細胞表型(圖1)。

2.2 葡萄糖消耗脂肪細胞模型篩選麥冬提取物結果 0.5、5、50mg/L OPSR可不同程度促進脂肪細胞葡萄糖消耗，呈劑量依賴性關系，葡萄糖消耗比值分別為32.27%、75.14%、90.47%，而OPG作用很弱，在50mg/L時葡萄糖消耗比值僅為8.49%。0.5、5、50mg/L OPSR+INS的葡萄糖消耗比值分別為127.37%、113.44%、101.61%，表明OPSR與INS聯合使用具有協同作用，能夠增加脂肪細胞對INS的敏感性，而OPG作用很弱(圖2)。

圖1 3T3-L1脂肪細胞誘導分化及油紅O染色結果Fig.1 3T3-L1 cells and induced adipocytes stained by oil red O

圖2 OPSR和OPG作用于3T3-L1細胞后葡萄糖消耗比值Fig.2 Relative value of glucose uptake of 3T3-L1 adipocytes treated with OPSR and OPG

2.3 3T3-L1脂肪細胞瘦素、脂聯素、抵抗素蛋白表達水平 各組瘦素、脂聯素、抵抗素蛋白表達量與對照組的倍數比(Folds of control)分別為：STZ組1.12±0.06、1.11±0.02、0.88±0.04；OPSR低濃度組1.01±0.01、1.04±0.01、0.97±0.02；OPSR中濃度組1.04±0.01、1.08±0.02、0.93±0.02；OPSR高濃度組1.07±0.01、1.14±0.04、0.88±0.02。與對照組比較，其他各實驗組瘦素、脂聯素蛋白表達量明顯提高且差異有統計學意義(P＜0.05)，STZ組、OPSR中濃度組和OPSR高濃度組抵抗素蛋白表達量顯著降低(P＜0.05，圖3)。

2.4 OPSR對T2DM大鼠體重及血液生化指標的影響 與正常大鼠比較，經高糖高脂飲食結合小劑量STZ注射，模型組大鼠出現多食、多飲、多尿、體重減輕等糖尿病臨床表現，TG和FBG明顯升高(P＜0.01)，FINs沒有明顯改變，但HOMA-IR顯著升高(P＜0.01)，出現明顯IR。說明T2DM病理模型建立成功。治療4周后，與模型組比較，OPSR高劑量組和RTZ組大鼠體重明顯增加，TG、FBG、HOMA-IR顯著降低(P＜0.05或P＜0.01)，IR明顯改善(表1)。

圖3 各組3T3-L1脂肪細胞的瘦素、脂聯素、抵抗素蛋白表達Fig.3 Expression of leptin, adiponectin and resistin protein of 3T3-L1 cells in different groups

表1 OPSR對T2DM大鼠BW、TG、FBG和FINs的影響(x±s, n=10)Tab.1 Effect of OPSR on BW, TG, FBG, FINs and HOMA-IR in T2DM rats n=10)

表1 OPSR對T2DM大鼠BW、TG、FBG和FINs的影響(x±s, n=10)Tab.1 Effect of OPSR on BW, TG, FBG, FINs and HOMA-IR in T2DM rats n=10)

(1)P＜0.01 compared with control group; (2)P＜0.05, (3)P＜0.01 compared with model group

Group BW(g) TG(mmol/L) FBG(mmol/L) FINs(mU/L) HOMA-IR Control group 325±52 0.97±0.15 5.93±1.04 17.8±2.3 4.67±0.11 Model group 286±34(1) 1.75±0.58(1) 13.93±1.98(1) 19.5±3.8 12.04±0.33(1)OPSR(200mg/kg) 314±31(3) 1.43±0.27(2) 6.43±1.39(3) 18.5±2.7 5.24±0.16(3)OPSR(100mg/kg) 309±47(2) 1.68±0.65 11.98±1.81(2) 20.8±4.7 11.07±0.38(2)OPSR(50mg/kg) 293±58 1.76±0.53 13.82±3.44 18.4±3.5 11.28±0.53 RTZ(2mg/kg) 321±39(3) 1.37±0.32(2) 5.81±1.08(3) 18.8±3.3 4.84±0.15(3)

3 討 論

IR是T2DM發病的始動因素，是機體對于胰島素效應性降低的一種狀態，表現為胰島素效應器官(肝臟、骨骼肌和脂肪)對胰島素的敏感性降低，其中脂肪組織是IR的始發部位。研究改善IR的藥物對于治療T2DM具有重要意義。Hong等[7]研究顯示麥冬水提物能明顯促進3T3-L1脂肪細胞基礎葡萄糖攝入和胰島素刺激下的葡萄糖攝入，表明麥冬水提物增加脂肪組織攝取葡萄糖的作用與其增加胰島素的敏感性有關。但麥冬水提物成分復雜，物質基礎不清，具體何種成分在此過程中起主要作用需要進一步研究。本實驗建立了3T3-L1誘導的脂肪細胞葡萄糖消耗和IR模型，結合大鼠T2DM模型，從細胞、分子和動物整體水平全面研究了麥冬主要有效成分OPSR、OPG在降糖和增加胰島素敏感性中的作用及其機制。

本研究結果顯示，OPSR可促進3T3-L1誘導的脂肪細胞利用葡萄糖，增加胰島素的敏感性，而OPG作用不明顯，初步推測Hong等[7]研究中麥冬水提物促進3T3-L1脂肪細胞葡萄糖攝入和增加胰島素敏感性的主要有效成分是OPSR。但是高昌琨等[8]報道OPG對四氧嘧啶、腎上腺素及葡萄糖所致的小鼠高血糖均有明顯降糖效果，說明單純以脂肪細胞為研究對象還不能完全排除OPG的降糖作用，還需要進一步探討其對胰島素效應器官骨骼肌和肝臟的作用，并對動物實驗進行重復研究。T2DM大鼠模型實驗結果顯示，OPSR能夠降低T2DM大鼠BW、FBG、TG、FINs和HOMA-IR，說明OPSR可以通過改善IR治療T2DM及其引起的代謝綜合征。脂肪組織產生并釋放多種脂肪細胞因子，這些脂肪細胞因子分為兩大類：一類是具有減弱胰島素生理功能的細胞因子，如抵抗素、TNF-α等，它們可以誘發和增強IR，從而降低胰島素敏感性；另一類是具有增強胰島素生理功能的細胞因子，如脂聯素[9]等，它們可以改善IR，從而增強細胞對胰島素的敏感性。本實驗結果顯示，OPSR能夠劑量依賴性地提高胰島素抵抗3T3-L1脂肪細胞瘦素、脂聯素蛋白表達量，而降低抵抗素蛋白表達量，說明OPSR降糖作用與IR脂肪細胞分泌的脂肪因子有關，可以通過促進脂肪細胞高表達瘦素、脂聯素以及抑制脂肪細胞表達抵抗素等脂肪因子而增強脂肪細胞胰島素敏感性，進而促進對葡萄糖的攝取和利用。

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