人脂肪干細胞復合Ⅰ型膠原支架材料構建脂肪組織的實驗研究

鐘振東，傅 榮，游曉波，魯 峰

(1.四川省醫學院科學院·四川省人民醫院a.實驗動物研究所，b.整形外科，四川 成都 610072;2.南方醫科大學南方醫院整形外科，廣東 廣州 510515)

雖然組織工程已經發展了近20年［1，2］，許多工程化組織和器官已經出現在生物醫學領域，有些已經用于臨床。然而，應用脂肪細胞組織工程技術修復軟組織缺損近期才引起學者們的關注［3～5］。雖然脂肪組織工程的方案還未到能夠應用于臨床階段，但是已經有體內研究的證據［6～9］。2010～2012年四川省醫學院科學院·四川省人民醫院與南方醫科大學南方醫院通過將細胞和Ⅰ型膠原支架材料復合培養，移植裸鼠皮下，探討構建工程化脂肪組織的適宜方法，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物:42只出生4～6周的裸鼠(品系為BALB/c，體重18～23 g)。主要儀器:CO2培養箱(Heraeus，德國);液氮罐(CBS，美國);離心機(Heraeus，德國);倒置相差顯微鏡(Olympus，日本)。主要試劑:DMEM、胎牛血清由 Gibco公司生產;I型膠原酶、胰蛋白酶、I型膠原支架材料、四氮唑復合物(XTT)，硫酸酚嗪甲酯和二甲基亞砜均購自 Sigma，12孔細胞培養板購自 Corning。

1.2 脂肪組織來源的脂肪干細胞(ADSCS) 原代、傳代培養取人吸脂術中吸出的脂質部分，用緩沖液反復沖洗，剪刀剪碎。0.1%膠原酶37℃消化40 min，期間需反復震蕩混勻1次，使用等量體積的完全培養基中和后，離心1200 g×5 min，去上清，沉淀混懸后使用肽盼藍染色檢測細胞活性，加入10%DMEM培養基中，37℃5%CO2孵箱培養過夜。待細胞生長融合達80%即可傳代，取第3～4代細胞供實驗用。

1.3 細胞-支架復合物的形成 將膠原蛋白支架材料裁制成10 mm×10 mm×1 mm大小，利用紫外線照射及酒精浸泡消毒，培養液平衡后待用。培養的脂肪干細胞消化后制成細胞懸液，細胞密度為2×105/ml，表面種植0.2 ml細胞懸液，靜置4 h后，加入含20%胎牛血清的 DMEM培養液，37℃、5%CO2培養箱中培養5 d。

1.4 細胞-支架復合物移植 取4～6周齡大裸鼠，氯氨酮麻醉，常規消毒鋪巾。無菌條件下在其背部中線兩側皮下，對稱鈍性分離出2個潛腔，分別植入ASCs+材料(左側)和空白材料(右側)。無菌絲線縫合皮膚。

1.5 組織工程新生物大體觀察和生物學檢測 移植后12周處死動物，將新生組織取出，給予大體觀察和濕重測定。組織工程新生物常規冰凍切片，倒置顯微鏡，激光共聚焦顯微鏡，掃描電鏡觀察。

2 結果

2.1 大體觀察 所有裸鼠術后均活動如常，植入處表面皮膚完整、光滑，無炎癥反應，植入物無脫出，無免疫排斥反應，無死亡。

2.2 組織工程新生物大體觀察和濕重測定 于移植后12周處死動物，取出材料進行大體觀察。從復合細胞的支架材料側獲取了約黃豆大小(約4 mm×4 mm×2 mm)的脂肪樣新生組織，空白支架對照側未見新生組織塊。對新生物進行了濕重測定，新生組織平均濕重0.019 g，見圖1。

圖1 新生物取材 a:實驗側新生組織;b:對照側(空白支架)無肉眼可見新生組織塊;c:新生物大體測量及濕重測定

2.3 組織學檢測 新生組織的HE染色觀察發現其組織結構與正常脂肪組織相似(圖2a)且油紅0染色陽性(圖2b)，證明新生組織為脂肪組織。

3 討論

組織工程學的研究主要集中在生物可降解支架材料、種子細胞、體外培養條件等方面，其中理想的三維支架的構建是組織工程化人工器官、組織研究成功的前提條件［9，10］。細胞與支架材料的相互作用是組織工程所需要考慮的關鍵問題之一，膠原蛋白是目前組織工程學研究中最常用的天然生物材料，由多種糖蛋白分子組成，占機體總蛋白的 30%(85%為I型膠原蛋白)，它具有多方面的生物活性，不僅是組織支持物，而且是細胞外間質的重要成分［11，12］。研究表明，膠原蛋白生物相容性好，降解速度可調，而且可參與組織修復，是優良的可引導組織再生的生物材料［13，14］。Ⅰ型膠原作為體外細胞培養支架時，有促進細胞粘附和誘導生長分化的作用，是良好的培養粘附劑［15，16］。故本實驗選擇膠原蛋白支架作為研究對象。

圖2 新生物組織學檢測a:HE染色見正常脂肪組織樣結構(×10);b:油紅0染色陽性，證實其含脂質成分

我們在研究中發現，將成脂誘導后的脂肪干細胞與Ⅰ型膠原支架復合體外混合培養，植入裸鼠皮下培植12周后，形成了黃豆大小的脂肪樣組織，經組織切片、油紅0染色等觀察證實為具有成熟結構脂肪功能的脂肪組織，而對照側(空白支架)未形成脂肪組織。研究顯示，ASCs作為種子細胞的確可以應用于脂肪組織的組織工程研究，并且能合成具有三維結構及功能完整的脂肪組織［17］。另外，I型膠原支架是優良的組織工程生物載體，其良好的生物相容性，對修復大范圍的軟組織缺損尤為理想［18，19］。

雖然本研究為今后的脂肪組織工程研究提供了一種可行的方案，但關于細胞培養，生物力學，細胞分化，新生血管，計算機模擬，支架生化特性等諸多方面仍需要大量細致的研究，才有可能將這項技術最終應用于臨床患者。

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