胰島素強化治療對高血糖肝損傷大鼠的治療效果觀察

馬俊勛，趙曉東，杜楠，楊麗萍，蘇琴，閆柏剛，楊雪嬌，李東惠，黨偉，張憲，姚詠明

近年來創傷患者逐漸增多，嚴重創傷應激性高血糖因被視為預后不良的預警指標越來越受到關注[1]。臨床上已有證據顯示胰島素強化治療可有效減少創傷后并發癥的發生，降低傷殘及病死率[2]，但動物實驗仍處于探索階段，尚無合適的動物模型來研究胰島素強化治療在嚴重創傷中的作用及具體機制。本實驗就建立高血糖創傷大鼠模型及胰島素強化治療對其肝臟的保護作用進行了探討。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑 Wistar大鼠購于軍事醫學科學院實驗動物中心，均為雄性，8～12周齡，體重120±20g，清潔級飼養。注射用鏈脲佐菌素(STZ)、D-半乳糖胺(D-gal，美國Sigma公司)，速眠新Ⅱ(北京軍事醫學科學院)。

1.2 方法

1.2.1 動物模型建立及分組 糖尿病模型制備：大鼠禁食12h，按55mg/kg體重腹腔注射STZ，3d后測尾靜脈血糖＞13.9mmol/L為糖尿病模型造模成功。肝損傷模型制備：將上述成模高血糖大鼠一次性腹腔注射D-gal(450mg/kg)，肝損傷標準為迅速激發肝損傷，肝酶活性水平至少升高至正常范圍上限的2倍以上。將成模大鼠隨機分成A、B兩組，A組為胰島素強化治療組(強化治療組，n=30)，B組為血糖相對控制組(常規治療組，n=30)。兩組大鼠均每日4次喂食，飲水不限。A組采用每日4次皮下注射，即早、中、晚喂食前注射普通胰島素，晚21:30注射中效胰島素，控制血糖在6～8mmol/L。B組根據每日3餐后的即時血糖注射普通胰島素，控制血糖在9～12mmol/L。血糖檢測采用美國強生血糖儀(檢測尾靜脈血糖)。兩組大鼠在肝損傷后均喂養1周。

1.2.2 一般情況觀察 觀察大鼠食欲、行為、毛發及死亡情況。

1.2.3 血生化檢測及病理觀察 分別于肝損傷模型制備前和制備后1、3、5、7d將兩組存活大鼠各處死5只(常規治療組在造模后7d僅存活4只)，經腹主動脈抽血，采用全自動生化分析儀檢測丙氨酸轉氨酶(ALT)、天冬氨酸轉氨酶(AST)、總膽紅素(T-Bil)、白蛋白(ALB)、總蛋白(TP)、堿性磷酸酶(ALP)含量。取1、3、5、7d處死大鼠肝臟右葉處組織，以10%中性甲醛液固定12～48h，制作病理切片，取第7天大鼠肝組織行組織電鏡觀察。制作正常大鼠肝臟病理切片作為對照。

1.3 統計學處理 采用SPSS 13.0軟件進行統計分析，計量資料以表示，經方差齊性檢驗后兩組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 大鼠造模后一般情況及胰島素治療后死亡情況觀察 注射STZ造模3d后，大鼠尾靜脈測血糖均＞13.9mmol/L。隨后腹腔注射D-gal，大鼠逐漸出現懶動，進食、進水減少，反抗力度減弱，精神疲憊，毛發站立，步態不穩等現象，部分大鼠出現尿量減少，尿色變黃，大便次數增多，且不成形，呈稀糊樣。造模成功后兩組大鼠中僅強化治療組死亡2只。給予胰島素治療后，常規治療組死亡6只(其中第1天4只，第2、7天各1只)。與常規治療組相比，強化治療組大鼠相同時間段懶動、進食水、反抗力度、步態及二便等情況明顯改善，大鼠死亡數量明顯減少，共死亡3只(其中第1天1只，第2、5天各1只)。兩組大鼠病死率差異有統計學意義(P＜0.01)。

2.2 胰島素強化治療后創傷高血糖大鼠肝功能變化模型制備后第1天，常規治療組與強化治療組大鼠肝功能指標差異無統計學意義(P＞0.05)。第3天與常規治療組比較，強化治療組肝功能開始降低，第5、7天肝功能明顯降低，至第7天基本接近正常，而常規治療組雖較前有所下降，但仍高于正常，兩者差異有統計學意義(P＜0.05或P＜0.01，表1)。

2.3 胰島素強化治療后高血糖大鼠肝臟的病理變化 正常大鼠肝臟呈紅褐色，有光澤，質軟，表面光滑。常規治療組大鼠各時間點肝臟均代償性增大，有出血。強化治療組各時間點肝臟稍增大，表面有少許出血點。正常肝臟常規HE染色見肝小葉結構完整，肝細胞多為單核，肝細胞索排列整齊，肝板呈條索狀，圍繞中央靜脈呈放射狀排列，肝細胞呈多邊形，核大而圓，位于肝細胞中央；肝竇內及匯管區可見少量淋巴細胞浸潤，無纖維組織增生(圖1A)。肝損傷模型常規病理切片見肝小葉結構破壞，肝細胞變性、糖原消失、局灶性炎性浸潤，部分肝細胞破裂，匯管區大量炎性細胞浸潤(圖1B)。常規治療組HE染色與肝損傷模型病理所見基本一致，第1、3天時肝細胞變性壞死，炎性細胞浸潤，以匯管區顯著，至第7天時炎性細胞有所減少，出現少許增生的新生肝細胞(圖1C－F)。強化治療組HE染色見肝小葉破壞較輕，肝小葉完整，肝細胞水腫減輕，第1天病理切片顯示肝細胞變性壞死稍減少，炎性細胞浸潤與常規治療組基本一致，第3、5天肝細胞變性壞死較前明顯減少，少量炎性細胞浸潤，開始出現新生肝細胞，第7天時肝臟基本恢復正常，炎性細胞消失(圖1G－J)。

2.4 透射電鏡觀察 正常大鼠肝細胞體積大小正常，排列緊密；肝細胞核呈圓形或卵圓形，大多單核，核內以常染色質為主，染色質均勻分布，核膜完整；胞質中粗面內質網發達，常分布于線粒體附近，滑面內質網較少，線粒體豐富，內嵴清楚；次級溶酶體偶見，以髓樣結構為主；胞質中有時可見脂滴，形狀接近圓形或卵圓形(圖2A)。常規治療組可見肝細胞體積增大，胞質疏松，細胞器分散，胞質中脂滴較多；粗面內質網擴張，部分核蛋白體從膜上脫落；線粒體腫脹，嵴斷裂或崩解，部分外膜破損；部分胞質中出現呈髓樣結構的次級溶酶體(圖2B)。強化治療組肝細胞體積正常，細胞核染色質較均勻分布，部分核膜不完整；細胞質中各細胞器無明顯變化，線粒體和粗面內質網體積數量均正常，偶可見初級溶酶體(圖2C)。

表1 肝損傷大鼠胰島素強化治療后肝功能變化s, n=5)Tab.1 Liver function changes after intensive insulin therapy in wound rats ±s, n=5)

表1 肝損傷大鼠胰島素強化治療后肝功能變化s, n=5)Tab.1 Liver function changes after intensive insulin therapy in wound rats ±s, n=5)

(1)P＜0.05, (2)P＜0.01 compared with conventional treatment group

Group Before model establishment After model establishment 1d 3d 5d 7d Conventional treatment group ALT(U/L) 38.4±13.5 247.2±23.3 206.3±21.6 144.3±23.1 78.7±18.7 AST(U/L) 157.0±12.9 268.6±27.9 245.6±23.9 213.8±24.4 185.3±18.6 T-Bil(μmol/L) 4.98±2.24 21.35±4.30 19.02±5.65 14.56±9.40 10.43±7.30 ALB(g/L) 32.1±0.9 24.1±1.9 23.2±1.6 25.8±0.8 27.6±0.9 TP(g/L) 50.0±2.7 33.8±3.5 36.5±5.5 39.8±9.8 45.8±6.3 ALP(U/L) 208.1±29.1 346.2±28.4 316.3±30.2 285.6±23.4 243.6±24.3 Intensive insulin group ALT(U/L) 40.1±12.1 256.4±21.3 187.2±14.8(2) 103.5±19.8(2) 42.3±14.7(2)AST(U/L) 151.0±12.0 265.7±18.4 221.5±20.6(2) 187.5±15.3(2) 164.3±13.6(2)T-Bil(μmol/L) 5.23±1.98 20.16±10.30 15.40±7.42(1) 10.45±4.33(1) 6.52±2.05(2)ALB(g/L) 31.6±0.8 23.6±1.1 26.6±1.2(2) 28.5±1.8(2) 30.2±0.8(2)TP(g/L) 51.3±2.9 35.6±3.1 38.2±2.5(2) 44.8±3.2(1) 48.7±2.4(1)ALP(U/L) 205.6±26.3 335.5±30.2 294.2±30.2(2) 253.6±20.3(2) 223.3±25.2(2)

圖1 大鼠肝組織病理變化觀察(HE)Fig.1 Changes of hepatic pathology (HE)

3 討 論

圖2 肝細胞透射電鏡觀察(×5000)Fig.2 Observation of hepatic cells by transmission electron microscope(×5000)

嚴重創傷患者多因感染[3]、多臟器衰竭[4]等死亡，其中凝血系統紊亂、內皮細胞損傷均與肝臟損傷相關，嚴重者將發生肝衰竭，導致一系列臨床后果。因此，在動物實驗中，需要選擇一個好的肝臟損傷動物模型，以幫助解決臨床無法實現的藥物篩選、基礎研究、新技術應用等難題。STZ是一種廣譜抗菌素，具有抗菌、抗腫瘤活性，以及致糖尿病的副作用，對動物的胰島細胞具有高度選擇毒性作用[5-9]，是目前廣泛采用的糖尿病動物模型化學誘導劑[10]。有研究指出，大鼠尾靜脈注射STZ的成模率可達90%[11]。因腹腔注射較尾靜脈注射簡捷、準確、快速，現多采用腹腔注射法。本實驗經STZ腹腔注射后，大鼠血糖均大于13.9mmol/L，成功造模，且病死率極低。

目前常用的肝損傷模型包括化學性、免疫性、酒精性肝損傷動物模型以及外科手術動物模型[12-21]等。參照國內外文獻，本實驗采取D-gal腹腔注射制備大鼠肝損傷模型。雖然D-gal作為肝毒劑已被公認，但其造成肝損傷的劑量國內外報道差別較大(100～2300mg/kg)。劉霞等[22]對此模型進行了改進，給予一次性腹腔注射450mg/kg D-gal，制成的急性肝損傷模型具有肝損傷指標明確，病變恒定，重復性好，器官選擇性強，周期短，給藥適量，動物存活率高等特點。

本課題組查閱文獻未發現穩定的嚴重創傷應激性高血糖動物模型，預實驗制備的創傷性休克大鼠模型血糖不理想，僅有20%的大鼠血糖較正常高，且未達到標準，大鼠病死率也較高，故本研究先制備大鼠高血糖模型，再行肝損傷模型制備，取得了較滿意的結果。實驗大鼠全部造模成功，造模成功后兩組大鼠中僅強化治療組死亡2只。造模成功后給予胰島素治療，其中常規治療組共死亡6只，強化治療組死亡3只，兩組病死率差異有統計學意義(P＜0.01)。

本研究中大鼠肝損傷后出現了較為顯著的肝功能障礙，表現為ALT、AST、T-Bil升高，ALB、TP降低，ALP升高。與常規治療比較，胰島素強化治療可增加ALB、TP含量、降低ALP水平，明顯保護損傷肝臟，且隨著時間推移，保護功能加強，至第7天時，強化治療組大鼠肝功能已基本恢復正常。而常規治療組肝功能雖較治療前有所降低，但仍明顯高于強化治療組，表明血糖相對控制后肝臟仍有明顯損傷，而胰島素強化治療有效降低血糖后，能使受損肝臟得以修復，避免肝衰竭的發生。

肝臟病理大體標本顯示，強化治療組大鼠肝臟基本與正常肝臟一致，有光澤，質軟，表面光滑，僅有少許出血點。常規治療組肝臟則明顯增大，色澤暗黑，質地稍硬，有多處出血。HE染色顯示常規治療組肝細胞變性壞死，炎性細胞浸潤，以門管區顯著，肝小葉破壞。強化治療組肝小葉完整，肝細胞水腫輕，可見新生肝細胞，至第7天時肝臟基本恢復正常，炎性細胞消失。肝組織透射電鏡觀察結果與上述一致。

綜上所述，肝損傷后肝功能異常，伴隨病理改變和肝細胞超微結構變化，給予胰島素強化治療后，肝功能、病理及電鏡觀察均明顯改善，提示胰島素強化治療控制應激性高血糖后，能降低包括肝衰竭在內的多器官功能衰竭。

[1]Hao DF, Chai JK, Shen CA, et al. Combined use of recombinant human growth hormone and intensive insulin therapy in the treatment of severely burned patients[J]. Med J Chin PLA, 2007,32(12): 1217-1219. [郝岱峰, 柴家科, 申傳安, 等. 胰島素強化治療與重組人生長激素在危重燒傷救治中的聯合應用[J].解放軍醫學雜志, 2007, 32(12): 1217-1219.]

[2]Zhang SL, Li QW, Fan XH, et al. Effects of intensive insulin therapy on the activity of nuclear factor kappa B in PBMC of the patients with critical illness complicated by hyperglycemia[J].Med J Chin PLA, 2008, 33(2): 207-209. [張勝蘭, 李乾望, 范西紅, 等. 胰島素強化治療對危重癥合并高血糖患者外周血單核細胞NF-κB活性的影響[J]. 解放軍醫學雜志, 2008,33(2): 207-209.]

[3]Huang J, Bai X, Zhang K, et al. Value of leucocyte count and C-reactive protein on bacterial infection of traumatic patients[J]. J Zhengzhou Univ (Med Sci), 2011, 46(5): 800-801. [黃津, 白雪,張凱, 等. 白細胞計數和C-反應蛋白對創傷患者細菌感染的診斷價值[J]. 鄭州大學學報(醫學版), 2011, 46(5): 800-801.]

[4]Liu HY, Pei H, Pang W, et al. Risk factors analysis of mortality in patients with multiple organ dysfunction syndrome after abdominal trauma[J]. J Zhengzhou Univ (Med Sci), 2009, 44(5):1052-1055. [劉海燕, 裴輝, 龐偉, 等. 腹部創傷合并多器官功能障礙綜合征患者病死危險因素分析[J]. 鄭州大學學報(醫學版), 2009, 44(5):1052-1055.]

[5]Guo XJ, Zou YH, Wu L, et al. Factors affecting the diabetic models induced by streptozocin in SD and wistar rats[J]. Acta Lab Anim Sci Sinica, 2008, 16(4): 301-304. [郭學軍, 鄒移海, 吳凌,等. 鏈脲佐菌素誘導SD和Wistar大鼠糖尿病模型的影響因素[J]. 中國實驗動物學報, 2008, 16(4): 301-304.]

[6]Liu XZ, Xiao H. Study on diabetic model in rats induced by streptozotocin[J]. J Jingzhou Med Coll, 2001, 22(4): 11-14. [劉學政, 蕭鴻. 鏈脲佐菌素致糖尿病大鼠模型的研究[J]. 錦州醫學院學報, 2001, 22(4): 11-14.]

[7]Wu QH, Gu WW, Yuan J. Observation of diabetes rat induced by streptozotocin[J]. Lab Anim Comp Med, 2006, 26(4): 247-248.[吳清洪, 顧為望, 袁進. 鏈脲佐菌素誘導1型糖尿病大鼠體征觀察[J]. 實驗動物與比較醫學, 2006, 26(4): 247-248.]

[8]Liu FH, Guo HG, Lou Q, et al. Primary observation on hyperglycemic models in mongolian gerbils induced by different dosage of streptozotocin[J]. Lab Anim Comp Med, 2010, 30(5):335-339. [劉鋒華, 郭紅剛, 樓琦, 等. 不同劑量鏈脲佐菌素誘發長爪沙鼠高血糖模型的初步觀察[J]. 實驗動物與比較醫學, 2010, 30(5): 335-339.]

[9]Zhang J, Wu JF, Zheng HE, et al. Experimental study on diabetic model of rats induced by streptozotocin[J]. J Hebei North Univ(Med Ed), 2006, 23(4): 6-8. [張靜, 吳靖芳, 鄭慧娥, 等.鏈脲佐菌素致大鼠糖尿病模型的實驗研究[J]. 河北北方學院學報(醫學版), 2006, 23(4): 6-8.]

[10]Rakieten N, Rakieten ML, Nadkarni MV. Studies on the diabetogenic action of streptozotocin(NSC-37917)[J]. Cancer Chemother Rep, 1963, 29: 91-98.

[11]Huang B, Liu XZ, Pang DB. Study on diabetic model in rats induced by Streotozotocin in different ways[J]. J Jingzhou Med Coll, 2003, 24(1): 19-21. [黃波, 劉學政, 龐東渤. 不同途徑注射鏈脲佐菌素致大鼠糖尿病模型的研究[J]. 錦州醫學院學報, 2003, 24(1): 19-21.]

[12]Zhang XW, Geng XL, Huang LH, et al. Contrast experiment of rat and mice liver injury induced by carbon tetrachloride[J].Basic Med Sci Clin, 2003, 23(3): 351-352. [張孝衛, 耿秀蘭, 黃麗華, 等. 四氯化碳致大鼠、小鼠肝損傷的對比實驗[J]. 基礎醫學與臨床, 2003, 23(3): 351-352.]

[13]Nakama T, Hirono S, Moriuchi A, et al. Etoposide prevents apoptosis in mouse liver with D-galactosamine/lipopolysaccharide-induced fulminant hepatic failure resulting in reduction of lethality[J]. Hepatology, 2001, 33(6): 1441-1450.

[14]Gu CH, Zhu BL, Xu J, et al. Study of mice hepatic injury indeced by D-galactosamine[J]. Occup Health, 2009, 25(22): 2364-2366. [顧呈華, 朱寶立, 徐軍, 等. D-半乳糖誘導小鼠肝損傷模型的方法研究[J]. 職業與健康, 2009, 25(22): 2364-2366. ]

[15]Macrides TA, Naylor LM, Kalafatis N, et al. Hepatoprotective effects of the shark bile salt 5beta-scymnol on acetaminopheninduced liver damage in mice[J]. Fundam Appl Toxicol, 1996,33(1): 31-37.

[16]Yang SC, Yang CH, Ma XF, et al. An experimental study of acute immune liver injury model established by intraperitoneal injection of BCG and LPS on mouse[J]. Lab Anim Sci, 2008,4(8): 1-4. [楊舒淳, 楊昌華, 馬小凡, 等. 小鼠腹腔注射卡介苗加脂多糖建立急性免疫性肝損傷的實驗研究[J]. 實驗動物科學, 2008, 4(8): 1-4.]

[17]Nicoletti F, Beltrami B, Raschi E, et al. Protection from concanavalin A (Con A)-induced T cell-dependent hepatic lesions and modulation of cytokine release in mice by sodium fusidate[J]. Clin ExpImmunol, 1997, 110(3): 479-484.

[18]Tong Y, Yan XD. Research of acute liver injury induced by carbon tetrachloride[J]. Chin J Food Hyg, 2000, 12(6): 10-11. [童英,閆向東. 四氯化碳急性肝損傷敏感指標的研究[J]. 中國食品衛生雜志, 2000, 12(6): 10-11.]

[19]Fourneau I, Pirenne J, Roskams T, et al. An improved model of acute liver failure based on transient ischemia of the liver[J].Arch Surg, 2000, 135(10): 1183-1189.

[20]Awad SS, Hemmila MR, Soldes OS, et al. A novel stable reproducible model of hepatic failure in canines[J]. J Surg Res,2000, 94(2): 167-171.

[21]Niu Z. Report of acute hepatic failure rat medel induced by D-galactosamine[J]. J Chin Med, 1981, 61(6): 350. [鈕振. D-氨基半乳糖形成大鼠急性肝衰竭的初步報告[J]. 中華醫學雜志, 1981, 61(6): 350.]

[22]Liu X, Wang TL, Zhao JB, et al. Rat model of liver injury induced by D-galactosamine[J]. J China-Japan Friendship Hosp, 1996,10(4): 305-308. [劉霞, 王泰齡, 趙靜波, 等. D-半乳糖胺致大鼠急性肝損傷模型制作的改進[J]. 中日友好醫院學報,1996, 10(4): 305-308.]