舒尼替尼聯合自體DC及CIK細胞治療轉移性腎癌的臨床療效觀察

張亮，陳立軍，王亞林，趙立

腎細胞癌(renal cell carcinoma，RCC)是泌尿系統最常見的惡性腫瘤之一[1]，約30%的患者確診時已出現遠處轉移。腎癌根治術后仍有20%～40%的患者出現復發或轉移[2-3]。無遠處轉移患者的5年存活率為50%～95%，發生轉移的患者則降至5%[4]。RCC對放化療不敏感，免疫治療與分子靶向治療的出現為RCC的治療提供了新的途徑。本研究對解放軍307醫院泌尿外科2009年1月－2011年6月收治的應用舒尼替尼(sunitinib，商品名：索坦)聯合自體樹突細胞(dendritic cell，DC)及細胞因子誘導的殺傷細胞(cytokine induced killer，CIK)進行治療的27例轉移性腎癌患者的資料進行分析，初步評價其療效及安全性。

1 資料與方法

1.1 研究對象 27例轉移性腎癌患者中男23例，女4例，年齡34～79歲，平均55.2歲。均行腎癌根治術，左側18例，右側9例，術后病理示透明細胞癌23例、混合細胞癌2例、集合管癌1例、顆粒性細胞癌1例，病理分級為T1～3N0～1M0。術后肺部轉移17例，肺轉移合并骨轉移3例，腎上腺轉移2例，雙側腹股溝合并腹膜后轉移1例，胸壁轉移1例，對側腎轉移合并肺轉移1例，肝轉移合并顱內轉移1例，肺部轉移合并腹膜后轉移1例，每例患者最少有1處可測量病灶(目標病灶)。27例患者均于術后2年內發生轉移，發現轉移后即入院治療。所有患者或法定代理人知情并簽署《知情同意書》接受治療，并報醫學倫理委員會批準。入選標準：①腎癌根治術后患者；②已有轉移并至少有1處可測量病灶，即為目標病灶；③Karnofsky評分60～90分；④未接受過系統治療；⑤首次靶向、免疫細胞治療；⑥無明顯過敏體質，無嚴重基礎疾病；⑦愿意配合詢問病史及體檢并能夠理解問卷內容。DC和CIK的分離及培養委托解放軍307醫院腫瘤生物治療中心進行。

1.2 外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)的分離 采集患者外周血，經Ficoll淋巴細胞分離液從單個核細胞分離淋巴細胞。采用生理鹽水洗滌PBMCs 3次，采用無血清培養基懸浮于培養瓶，置37℃、5%CO2孵育箱。配制DC完全培養基150ml，含2‰白細胞介素-4(IL-4)、2‰粒-巨噬細胞集落刺激因子(GMCSF)，其中120ml用于當天DC培養，30ml用于第3天DC補液。

1.3 DC細胞的培養與回輸治療 取貼壁PBMCs，加入事先配好的DC完全培養液，置于37℃、5%CO2培養箱中培養。第3天添加含2‰IL-4、2‰GMCSF的培養液5ml。第6天細胞轉染入腫瘤抗原并加入促成熟因子、沉默免疫負調控基因(inhibition of antigen presentation attenuators，iAPA)因子和4‰腫瘤壞死因子-α(TNF-α，1000U/ml)混合液。第7天收集成熟DC，離心后分裝。1份用生理鹽水洗滌后配制懸液1ml，加入2%人血白蛋白，當天回輸，之后分別于第9、11、13天回輸。DC質控標準如下。①細胞數：皮下四位點注射，每個注射點的量為1.5×106個細胞(0.2ml)；②細胞形態分類：回輸細胞良好；③活細胞比例：≥95%；④回輸前內毒素、細菌、真菌、支原體檢測應為陰性。

1.4 CIK細胞的培養與回輸治療 取貼壁的PBMCs加入無血清培養基，使CIK培養的初始密度為(1～2)×106/ml；加入1‰ IFN-γ，裝入細胞培養袋，置于37℃、5%CO2培養箱中培養。第1天添加1‰ CD3單抗及1‰ IL-2，在培養過程中根據細胞生長狀況適量添加含1‰ IL-2的培養液。第6、11天添加或換液，第10、12天取100μl CIK行革蘭染色。第11、13天收集CIK細胞，洗滌后回輸。CIK質控標準如下。①細胞數：兩次回輸細胞＞1×109個；②細胞形態分類：回輸細胞良好，淋巴細胞＞90%；③活細胞比例：≥95%；④免疫熒光染色：CD3+≥85%，CD8+≥60%，顯示活化良好；⑤回輸前內毒素、細菌、真菌、支原體檢測陰性。

1.5 治療方案 索坦50mg，1次/d，口服。服藥4周，停藥2周(4/2給藥方案)。藥物治療直至腫瘤進展或者出現Ⅲ或Ⅳ級不良反應需要減量或停藥。減量方案：索坦37.5mg，1次/d，同樣4/2給藥方案，若仍無法糾正不良反應則停藥。靶向治療完成一個療程后，以上述方案回輸DC細胞和CIK細胞，間隔6個月后行下一個療程的細胞免疫治療。

1.6 指標觀測及療效評估

1.6.1 療效評估 治療前1周及細胞免疫治療后2周行影像學檢查評估療效并在下一個療程結束后進行確認，參照RECIST實體瘤療效評價標準評估療效。①完全緩解(CR)：所有靶病灶消失，無新病灶出現，且腫瘤標志物正常，至少維持4周；②部分緩解(PR)：靶病灶最大徑之和減少≥30%，至少維持4周；③疾病穩定(SD)：靶病灶最大徑之和縮小未達PR，或增大未達PD；④疾病進展(PD)：靶病灶最大徑之和增加≥20%，或出現新病灶。客觀緩解率(ORR)=(CR+PR)/總例數×100%。疾病控制率(DCR)=(CR+PR+SD)/總例數×100%。

1.6.2 生活質量評估 以Karnofsky為標準比較治療前1周與細胞免疫治療后2周患者的生活質量[5]。提高大于10分為改善，下降大于10分為惡化，提高或下降少于10分者為穩定。總提高率=(改善+穩定)/總例數×100%。

1.6.3 免疫學評估 于治療前1周及細胞免疫治療后2周采集患者外周血，采用流式細胞法檢測其中T淋巴細胞CD3、CD4、CD8和HLA-DR的陽性率，了解治療前后機體免疫水平。

1.6.4 安全性評估 參考加拿大國家癌癥研究所的常見毒性標準(NCIC-CTC)[6]，隨訪觀察患者在治療過程中的不良反應。

1.7 統計學處理 采用SPSS 19.0軟件進行統計分析。無疾病進展生存時間(PFS)、總生存時間(OS)和95%置信區間(CI)估計采用Kaplan-Meier方法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 療效觀察 根據RECIST行療效評估，全部患者均治療超過1個周期，1個周期后評價CR 0例，PR 4例，SD 17例，PD 6例。ORR為14.8%(4/27)，DCR為77.8%(21/27)。隨訪4～25個月，8例患者目前仍在接受聯合治療，其中1例患者服用索坦第15周時出現了血小板降低，最低為51×109/L，索坦減量后得以糾正；2例患者因索坦減量后仍無法耐受不良反應停藥(分別為骨髓抑制和高血壓)；1例患者因自身經濟原因停藥；14例患者疾病進展，無疾病進展生存時間(PFS)為4.0～19.5個月；10例患者死亡，總生存時間(OS)為6～21個月。全部27例患者中位PFS為16個月(95%CI 12.5～19.5)，中位OS未達到。

2.2 生活質量 以Karnofsky為標準比較治療前1周與聯合治療后2周患者的生活質量，其中4例改善，16例穩定，7例惡化。KPS評分總提高率為74.1%(20/27)。

2.3 免疫評估 對27例轉移性腎癌患者于治療前及聯合治療第一個療程后2周分析外周血T淋巴細胞亞群百分數，結果顯示，經靶向及細胞免疫治療后，CD4+、CD8+和CD3+T淋巴細胞百分數較治療前升高(P＜0.05)，而HLA-DR+T淋巴細胞百分數與治療前比較差異無統計學意義(P＞0.05，表1)。

2.4 安全性及不良反應 靶向治療期間，1例患者在服用索坦的第15周出現血小板降低，最低為51×109/L，藥物減量至37.5mg、1次/d維持治療。2例患者因索坦減量后仍無法耐受不良反應(分別為骨髓抑制和高血壓)停藥，其他不良反應均在Ⅰ-Ⅱ級，其中最常見的為乏力、手足綜合征、高血壓、血小板減少、甲狀腺功能減低和中性粒細胞減少等，經對癥治療后可緩解或耐受，不影響后續治療。細胞治療期間，5例患者細胞輸注后出現一過性發熱反應(37.4～38.2℃)，數小時后均可自行緩解。1例患者出現短暫頭暈，休息后緩解。細胞回輸后行血常規、肝腎功檢查，未見明顯變化。

表1 27例聯合治療患者治療前后外周血T細胞表型變化(%，s，n=27)Tab.1 Changes of T-cell phenotype in peripheral blood of 27 patients before and after combination treatment (%,, n=27)

表1 27例聯合治療患者治療前后外周血T細胞表型變化(%，s，n=27)Tab.1 Changes of T-cell phenotype in peripheral blood of 27 patients before and after combination treatment (%,, n=27)

(1)P＜0.05, (2)P＜0.01 compared with before treatment

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3 討 論

腎癌作為一種惡性泌尿系腫瘤，其發病率在近年持續攀升，腹腔鏡腎癌根治術是當前治療腎癌的一項基本手段，尤其對于非轉移性腎癌是首選方案，但術后仍有一定的復發、轉移率，尤其是臨床Ⅱ、Ⅲ期腎癌，術后50%～70%出現轉移[4]，無遠處轉移患者的5年存活率為50%～95%，發生轉移的患者存活率則降至5%[2]。由于腎癌細胞存在多藥耐藥基因-1及其產物P-糖蛋白的過度表達，因此對化療藥物幾乎普遍抗拒，對放療亦不敏感。既往細胞因子治療有效率低，不良反應重，且大多無法持久。

索坦是三磷腺苷的強效競爭性抑制劑，可抑制多個受體酪氨酸激酶(RTK)，其中某些RTK參與了腫瘤生長、病理性血管形成和腫瘤轉移的過程[7]。索坦的作用靶點包括血小板衍生生長因子受體(PDGFRα和PDGFRβ)、血管內皮生長因子受體(VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3)、干細胞因子受體(KIT)、Fms樣酪氨酸激酶-3(FLT3)、1型集落刺激因子受體(CSF-1R)和神經膠質細胞系衍生的神經營養因子受體(RET)[5,8]。

體內回輸免疫活性細胞的過繼免疫療法是目前一種熱門的腫瘤治療方法。CIK兼具T淋巴細胞強大的抗腫瘤活性和NK細胞非主要組織相容性復合物(MHC)限制性殺瘤細胞的功能，且體內外增殖能力強，是一類殺瘤活性和殺瘤譜更強的新型抗腫瘤效應細胞。DC是迄今為止已知體內作用最強的抗原提呈細胞，其表面高表達MHC分子和各種共同刺激分子(如CD80和CD86)，可高效增殖活化未致敏T細胞，有效抵制腫瘤細胞的免疫逃逸。此外，DC還可通過直接或間接方式影響B細胞的增殖，活化體液免疫應答[9]。DC+CIK細胞回輸可以直接殺傷腫瘤，亦可間接誘導機體的自身免疫系統殺傷腫瘤，調節并增強機體的免疫功能，從而產生持續的抗腫瘤作用[10]。DC的發育分化過程伴隨著其由未成熟的前體細胞向成熟細胞的轉變，未成熟的DC(immature DC，imDC)與成熟DC(mature DC，mDC)在表型特征以及生物學功能上都有區別，imDC的最大特點是在體外可誘導T淋巴細胞特異性低應答。快速生長的腫瘤會持續分泌IL-10、VEGF、TGF-β等細胞因子，使浸潤于其中的DC持續處于未成熟狀態，這些存在于腫瘤周圍的未成熟DC不但會誘導機體對腫瘤產生免疫耐受，而且會促進內皮細胞定植并分化，誘導腫瘤新生血管形成。靶向治療聯合細胞治療的效果要好于單純靶向治療的原因可能在于靶向藥物(如索坦、索拉菲尼等)同時抑制了多條信號傳導通路，具有抗腫瘤和抗血管生成作用，使腫瘤微環境發生改變，抑制了相應趨化因子的產生，使部分imDC成功轉變為mDC從而發揮其抗原呈遞功能，誘導機體產生抗原特異性細胞毒性T淋巴細胞(CTL)，識別和殺傷腫瘤細胞；通過分泌C干擾素(IFN-C)等細胞因子從而抑制腫瘤血管生成；同時激發免疫記憶保護，在宿主再次受到腫瘤細胞攻擊時發揮保護作用。腫瘤靶向治療的同時可能也產生免疫治療的作用，因此療效更明顯。

Hwang等[11]回顧性分析了21例使用索坦治療的轉移性腎癌患者的臨床療效，中位PFS為13.4個月，中位OS為28.1個月。本組27例轉移性腎癌患者經靶向藥物聯合DC+CIK細胞治療后，中位PFS為16個月，與之前報道相比有所提高，而OS尚未得出，說明聯合治療可延長患者疾病無進展時間；T細胞CD4+、CD8+和CD3+百分數較治療前明顯提高，而外周血T細胞亞群CD4+、CD8+和CD3+是體現患者細胞免疫情況的重要指標。該結果提示經聯合治療后患者免疫功能得以改善。KPS評分總提高率為74.1%，提示聯合治療對改善患者生存質量也有所幫助。

本組27例聯合治療的患者中，以Ⅰ-Ⅱ級藥物不良反應為主，基本集中在靶向治療期間，以乏力、手足綜合征、高血壓、血小板減少、甲狀腺功能減低和中性粒細胞減少常見，經對癥治療可緩解，與之前索坦的常見不良反應報道相符。在免疫治療期間，只有少數幾例患者出現一過性發熱和頭暈現象，均能自行緩解。治療過程中僅1例靶向藥物減量，2例最終停藥，提示患者對聯合治療有著良好的耐受性。

總之，在本研究中，索坦聯合DC+CIK細胞治療轉移性腎癌的臨床療效較好，并可延長患者的疾病無進展時間，提高免疫功能，改善生存質量，耐受性較好，可能成為腎癌綜合治療的一條新途徑。

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