石杉堿甲的抗炎作用及其對大鼠神經干細胞的保護作用*

朱 寧， 林繼宗， 陳慶狀， 韋美丹， 王 勇△

阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)是以認知功能進行性下降和情感障礙為特點的神經退行性疾病［1］。淀粉樣 β 肽(amyloid beta-peptide，Aβ)沉積激活小膠質細胞引起的炎癥反應是導致AD患者腦內神經損傷和凋亡的重要原因。研究報道，從中藥千層塔中分離得到的一種石松類生物堿——石杉堿甲(huperzine A，HupA)，為乙酰膽堿酯酶抑制劑，在AD治療中效果顯著［2］。但HupA的其它AD治療機制尚不完全清楚，且目前關于HupA治療AD的研究靶點主要局限于已經成熟的功能性細胞［3-4］，很少關注HupA對神經細胞生成的影響，更少研究HupA對神經干細胞的作用。因此，本研究將建立大鼠小膠質細胞與神經干細胞共培養體系，在小膠質細胞層中加入Aβ1-42模擬AD患者腦內炎性微環境，觀察HupA對炎癥反應的作用，同時檢測神經干細胞凋亡率，明確HupA對神經干細胞的保護作用。

材料和方法

1 主要試劑及材料

新生SD大鼠(出生24 h內)由南方醫科大學實驗動物中心提供，許可證號為SCXK(粵)2011-0015。OX-42和 nestin I抗(Abcam)，抗小鼠 II抗(R＆D Systems)，0.4 μm Transwell培養板(Corning)，Aβ1-42(US Biological)，大鼠細胞因子檢測試劑盒(LINCO)，Bcl-2、Bax和 β-actin I抗(Cell Signaling)，核蛋白提取試劑盒(凱基)。

2 主要方法

2.1 細胞培養

2.1.1 神經干細胞的培養 取新生SD大鼠海馬，胰酶消化20 min，然后用10%FBS終止消化，過濾。濾液離心，細胞沉淀用含EGF、bFGF和B27的培養液重懸，調整細胞密度至1×109/L，接種，每隔3～4 d 半量換液［5］。

2.1.2 小膠質細胞的培養 取新生SD大鼠海馬，制成單細胞懸液以5×108/L的細胞密度接種于預先經多聚賴氨酸包被處理的培養瓶中，2 d后全量換液，待培養至9～10 d，手搖法分離純化小膠質細胞［6］。

2.1.3 免疫熒光染色鑒定小膠質細胞和神經干細胞 4%多聚甲醛固定細胞15 min;山羊血清封閉30 min，加入nestin I抗檢測神經干細胞，或加OX-42 I抗檢測小膠質細胞，4℃過夜，PBS漂洗，加入FITC(綠光)或TRITC(紅光)標記的II抗，避光孵育1 h，DAPI染核5 min，熒光顯微鏡拍照。

2.1.4 共培養體系的建立 Transswell共培養體系的建立參照本課題組前期研究方法進行［6］。

2.2 實驗分組 實驗分3組，所有操作平行進行。(1)空白對照組(control):神經干細胞和小膠質細胞以1∶1的比例依次接種于Transwell板的上層和下層;(2)Aβ組:細胞培養方法同空白對照組，于小膠質細胞層中加入終濃度為10 μmol/L的Aβ1-42;(3)HupA組:細胞培養方法同空白對照組，在小膠質細胞層中加入 10 μmol/L Aβ1-42前 4 h 用1 μmol/L HupA預處理小膠質細胞［7］。各組培養24、48和72 h后檢測白細胞介素6(interleukin 6，IL-6)、腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factor α，TNF-α)和巨噬細胞炎癥蛋白 1α(macrophage inflammatory protein 1α，MIP-1α)的濃度，72 h后用流式細胞術和 Western blotting檢測神經干細胞的凋亡情況。

2.3 液相芯片檢測 IL-6、TNF-α和MIP-1α的表達

相對于ELISA技術，液相芯片技術具有高通量、檢測過程簡單快速、準確性高和重復性好等特點。收集各組細胞培養上清液，依照LINCOplex Kit說明書檢測IL-6、TNF-α和MIP-1α濃度，主要步驟為:檢測試劑恢復到室溫，在測定板上滴加Buffer封閉濾板，室溫振搖10 min;分別加25 μL細胞培養上清液、梯度稀釋的標準品、空白和質控品到相應孔中;加混合微球，在振蕩器上室溫孵育2 h，用Wash buffer洗板2次，然后每孔加檢測抗體的混合液，在振蕩器上室溫孵育2 h;加抗生物素蛋白鏈菌素，孵育30 min;洗板后加檢測液，用Luminex液相芯片分析系統檢測炎癥因子濃度。

2.4 流式細胞術檢測神經干細胞凋亡率 收集各組神經干細胞，參照annexin V-FITC/PI檢測試劑盒說明書進行前期處理，用流式細胞術檢測細胞凋亡率。

2.5 Western blotting檢測Bcl-2和Bax表達 收集細胞，采用細胞核蛋白提取試劑盒提取各組神經干細胞核蛋白，BCA法蛋白定量，計算上樣量，按SDSPAGE凝膠電泳跑膠后，采用半干法轉膜，經封閉，Bcl-2、Bax和β-actin I抗孵育，II抗孵育后顯影。

3 統計學處理

用SPSS 16.0統計軟件分析，數據用均數±標準差(mean±SD)表示。多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD)，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 神經干細胞和小膠質細胞的鑒定

以DAPI和小膠質細胞特異性標志物OX-42進行熒光雙染，鑒定培養小膠質細胞的純度，結果顯示，所培養的小膠質細胞呈OX-42染色陽性且純度大于95%，符合實驗要求(圖1A)。神經干細胞標志物nestin對成形細胞球的檢測結果顯示nestin染色陽性(圖1B)。

2 HupA 抑制IL-6、TNF-α和 MIP-1α分泌

各組細胞處理 48 h后，Aβ組 IL-6、TNF-α和MIP-1α的濃度分別升高至空白對照組的3.8、4.6和4.9倍(P＜0.01)，且相對于24 h的濃度亦顯著升高;HupA組的IL-6、TNF-α和MIP-1α的濃度分別升至空白對照組的2.2、1.6 和2.4 倍，相對于 Aβ 組顯著降低(P＜0.01)。而在72 h后，Aβ組IL-6、TNF-α和MIP-1α的釋放量分別增至空白對照組的6.7、6.8和9.6倍(P ＜0.01);HupA 組 IL-6、TNF-α 和 MIP-1α的濃度分別為空白對照組的3.2、2.3和3.1倍，相對于Aβ組顯著降低(P＜0.01)，見圖2。

Figure 1.Identification of microglia and neural stem cells(NSCs).A:the microglial cells were positive for OX-42 staining(green);B:the NSCs were positive for nestin staining(red).圖1 小膠質細胞和神經干細胞的鑒定

Figure 2.Huperzine A(HupA)reduced the secretion of IL-6(A)，TNF-α (B)and MIP-1α (C).Mean±SD.n=6.＊＊P ＜0.01 vs control;##P＜0.01 vs Aβ.圖2 石杉堿甲減少IL-6、TNF-α和MIP-1α分泌

3 HupA降低神經干細胞凋亡率

流式細胞術檢測結果顯示，細胞處理72 h后，空白對照組神經干細胞凋亡率為3.04%;當小膠質細胞層中加入 Aβ1-42后，神經干細胞凋亡率升高至25.46%，差異有統計學意義 (P＜0.01);在Aβ1-42加入前用HupA預處理小膠質細胞，神經干細胞凋亡率降低至8.05%，與 Aβ組相比差異有統計學意義(P＜0.01)，見圖3。

4 HupA升高神經干細胞的Bcl-2/Bax值

Western blotting檢測結果顯示，細胞處理72 h后，Aβ組Bcl-2和Bax蛋白相對于β-actin的表達量最高，而Bcl-2/Bax值最低(P＜0.01);在Aβ1-42加入前預先用HupA處理小膠質細胞，Bcl-2/Bax值顯著升高，與Aβ組相比差異有統計學意義(P＜0.05)，見圖4。

討 論

Figure 3.HupA reduced the apoptotic rate of NSCs.The apoptosis of NSCs was detected by flow cytometry.Mean±SD.n=6.＊＊P ＜0.01 vs control;##P＜0.01 vs Aβ.圖3 石杉堿甲降低神經干細胞凋亡率

Figure 4.HupA elevated the Bcl-2/Bax ratio in NSCs.The expression of Bcl-2 and Bax was detected by Western blotting.Mean± SD.n=6.＊＊P ＜0.01 vs control;#P ＜0.05 vs Aβ.圖4 石杉堿甲對Bcl-2/Bax比值的影響

AD患者腦組織中聚積的Aβ持續作用于膠質細胞，形成的慢性炎癥反應，誘發神經元凋亡和抑制神經細胞生成，造成中樞神經細胞大量丟失。這可能是AD形成和病情加重的主要原因。HupA作為一種膽堿酯酶抑制劑，已在臨床應用治療AD，且有一定療效。有研究提示HupA可能作用于膽堿能受體而減弱炎性反應［8］。本課題組采用Transwell裝置在體外成功建立了神經干細胞與小膠質細胞共培養體系，在小膠質細胞中加入Aβ1-42模擬AD患者腦內炎癥微環境，以此探討HupA的抗炎作用與神經干細胞保護作用。研究發現，在Aβ1-42的刺激下，小膠質細胞分泌 IL-6、TNF-α和 MIP-1α，炎癥因子穿過 Tran swell半透膜，引起神經干細胞的凋亡。IL-6是一種具有多向性的細胞因子，在AD中大量表達，能通過誘導磷脂酶A2基因表達促進炎癥反應。而TNF-α是在炎癥反應中引發和調節細胞因子級聯反應的重要促炎細胞因子，它能夠刺激IL-1等多種細胞因子的表達，這些細胞因子反過來經各種機制持續放大炎性反應［9］。因此，抑制 TNF-α和 IL-6的產生對AD慢性炎癥反應的控制和微環境的改善有重要作用。不同于TNF-α和IL-6，MIP-1α是趨化因子C-C超家族中的一種，其趨化作用在AD中引起小膠質細胞向Aβ斑塊周圍的聚集，小膠質細胞受Aβ的刺激釋放包括MIP-1α在內的各種炎癥因子，形成一個惡性循環［10］。在HupA的作用下，小膠質細胞分泌的IL-6、TNF-α和MIP-1α顯著減少，產生明顯的抗炎作用。以往研究顯示這種作用是由于HupA抑制膽堿酯酶活性，增加乙酰膽堿水平，激活膽堿能受體后下調細胞因子和趨化因子的表達而產生的［8，11-12］。而我們的研究表明，HupA可直接作用于小膠質細胞，減少小膠質細胞炎癥因子的分泌，從而抑制炎癥反應。

HupA治療AD效果顯著。有研究顯示其可通過減少Aβ的產生和作用于神經生長因子信號通路對神經元起保護作用［7］，而本研究重點關注了HupA對神經干細胞的保護作用。流式細胞術檢測結果提示，HupA可通過作用于小膠質細胞，降低神經干細胞凋亡率，從而保護神經干細胞。同時，Western blotting檢測發現，HupA組神經干細胞Bcl-2/Bax值較Aβ組高。Bcl-2是重要的細胞凋亡抑制蛋白;Bax是Bcl-2蛋白家族中的一種，可拮抗Bcl-2的保護作用。Bcl-2蛋白家族中促凋亡和抑凋亡兩類蛋白的比例決定細胞在受到凋亡信號刺激后是否發生凋亡。當Bcl-2/Bax值降低，Bax形成同源二聚體誘導細胞凋亡;而當Bcl-2/Bax值增高時，Bax與Bcl-2形成異源二聚體，實現Bcl-2抑制細胞凋亡的功能［13］。我們發現，神經干細胞在Aβ1-42介導的炎癥反應刺激下，Bcl-2和 Bax表達量是各組中最高的，而Bcl-2/Bax值是各組中最低的。HupA預處理小膠質細胞后，液相芯片檢測發現炎癥因子分泌減少，同時，Bcl-2/Bax值顯著高于Aβ組，產生抑制神經干細胞凋亡的作用。Western blotting和流式細胞術檢測結果均提示HupA可抑制神經干細胞的凋亡。HupA減少炎癥因子分泌，降低神經干細胞凋亡率，對神經細胞的生存具有積極意義。因此，HupA治療AD的機制之一可能是通過直接作用于小膠質細胞，抑制小膠質細胞分泌細胞因子和趨化因子，減弱炎癥反應，改善神經細胞生長的微環境并促進神經細胞的存活。然而HupA作用于小膠質細胞的具體信號通路及機制還有待進一步探索。

綜上所述，HupA可以抑制小膠質細胞分泌細胞因子和趨化因子，改善炎癥微環境，并減少神經干細胞的凋亡，產生神經保護作用，為AD的神經干細胞療法提供了實驗基礎。

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