積雪草酸改善小鼠脂肪細胞胰島素抵抗的機制研究*

劉清霞， 葉開和， 王婧茹， 葉春玲△， 黃 儀， 張曉琦， 葉文才

(暨南大學藥學院1藥理學教研室，2中藥及天然藥物研究所，中藥藥效物質基礎及創新藥物研究廣東省高校重點實驗室，廣東廣州510632)

番石榴(Psidium guajava L．)為桃金娘科番石榴屬植物，廣泛分布于我國華南地區。上世紀80年代，我國在進行植物藥普查中發現，民間使用番石榴葉防治糖尿病和肥胖癥有效果，以番石榴葉粗提取物為原料的制劑“消渴降糖膠囊”的臨床療效顯著，但其降血糖的活性成分和作用機制尚不清楚。本課題組首次發現番石榴葉總三萜(total triterpenoids)是番石榴葉中抗糖尿病作用的主要有效部位，并能顯著降低2型糖尿病大鼠的血糖水平，改善胰島素抵抗［1］。積雪草酸(asiatic acid)為五環三萜類化合物，是番石榴總三萜的主要成分，已有研究發現其具有抗氧化，抗炎、肝臟保護和抗糖尿病作用［2-3］。為了深入探討積雪草酸的抗糖尿病作用及其機制，本研究采用3T3-L1脂肪細胞胰島素抵抗模型，觀察積雪草酸對3T3-L1前脂肪細胞增殖、分化以及胰島素抵抗脂肪細胞糖脂代謝的影響并探討其抗糖尿病作用機制。

材料和方法

1 材料

1．1 細胞 3T3-L1前脂肪細胞購自中國科學院上海細胞庫。于含10%胎牛血清高糖DMEM培養液中(含1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素)，置于37℃、濕度95%、5%CO2細胞培養箱內傳代培養，實驗均采用對數生長期細胞。

1．2 藥物與試劑 積雪草酸來源于番石榴的干燥葉，溶劑法純化工藝提取，純度為98%，實驗前用DMSO溶解，4℃保存。馬來酸羅格列酮(rosiglitazone maleate，Ros)購自上海源葉生物科技有限公司;正釩酸鈉(sodium orthovanadate，Van)購自阿拉丁公司;高糖DMEM購自Gibco;胎牛血清購自浙江天杭生物科技公司;油紅O購自Sigma;葡萄糖檢測試劑盒購自上海榮盛生物藥業有限公司;游離脂肪酸測定試劑盒購自南京建成生物科技有限公司。

1．3 儀器 NU-4750型二氧化碳培養箱(NuAire);TD80-2B離心機(上海安亭科學儀器廠);LAC-110．4型電子天平(Acculab);Model 680酶標儀(Bio-Rad);WO-9413B型凝膠成像系統(北京六一儀器廠)。

2 方法

2．1 3T3-L1前脂肪細胞的體外培養及誘導分化 將3T3-L1前脂肪細胞接種于細胞培養板，用含10%胎牛血清及青霉素、鏈霉素的高糖DMEM培養基，于37℃、濕度95%、5%CO2環境中培養。待細胞融合后，加含有0．5 mmol/L IBMX、1 μmol/L地塞米松和10 mg/L胰島素的高糖DMEM培養基誘導48 h后，換為含10 mg/L胰島素的高糖DMEM培養基再培養48 h，隨后換用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基繼續培養，每隔2 d換液，誘導分化8～12 d后，90%以上呈脂肪細胞表型可用于實驗。

2．2 MTT法測定3T3-L1前脂肪細胞增殖 將3T3-L1前脂肪細胞轉入96孔板中，調整細胞密度為5×103cells/well。設置空白對照組(control)、溶媒對照組(medium)、積雪草酸處理組、羅格列酮(10 μmol/L)對照組和正釩酸鈉(10μmol/L)對照組。空白對照組給予正常DMEM，溶媒對照組給予含0．1%DMSO的DMEM，積雪草酸處理組分為3、10、30和100 μmol/L。3T3-L1前脂肪細胞按照不同處理方法作用48 h后，每孔加入MTT(5 g/L)20μL，在37℃培養箱中孵育4 h后，吸出舊培養液，每孔加入150μL DMSO，混勻后置酶標儀主波長為570 nm，副波長為630 nm處測量吸光度值，觀察積雪草酸對3T3-Ll前脂肪細胞增殖的影響。增殖率(%)=(實驗組吸光度值－空白對照組吸光度值)/空白對照組吸光度值×100%。

2．3 油紅O染色鑒定3T3-L1前脂肪細胞分化 將3T3-L1前脂肪細胞轉入96孔板中，調整細胞密度為5×103cells/well，進行誘導分化實驗。在誘導分化第6 d加入不同濃度的藥物干預，藥物分組同2．2項，作用48 h后棄去培養液，用PBS洗3次，用10%多聚甲醛固定30 min，棄去固定液，用滅菌水洗3次，加入油紅O溶液染色30 min后棄之，用滅菌水洗3次，顯微鏡下觀察，然后用異丙醇充分溶解染色脂肪細胞內的油紅O，選擇520 nm波長在酶標儀上測定吸光度值，觀察積雪草酸對3T3-L1前脂肪細胞分化的影響。分化率(%)=(實驗組吸光度值－空白對照組吸光度值)/空白對照組吸光度值×100%。

2．4 3T3-L1脂肪細胞胰島素抵抗細胞模型的建立調整上述誘導分化成熟的3T3-L1脂肪細胞的細胞密度，轉入96孔板中，將其分為對照組和模型組(model)，對照組給予普通高糖DMEM培養基，模型組給予含有1μmol/L地塞米松的培養基，孵育96 h后取細胞上清液，用葡萄糖氧化酶法測定細胞上清液中葡萄糖的含量，用以反映胰島素抵抗的程度。葡萄糖消耗率(%)=(對照組葡萄糖含量－模型組葡萄糖含量)/對照組葡萄糖含量×100%。

2．5 藥物對胰島素抵抗3T3-L1脂肪細胞的糖脂代謝的影響 將分化成熟3T3-L1脂肪細胞轉入96孔板中，調整細胞密度為5×103cells/well，建立胰島素抵抗脂肪細胞模型。確定造模成功后分為空白對照組、溶媒對照組、積雪草酸(3、10、30和100μmol/L)處理組、羅格列酮(10μmol/L)對照組和正釩酸鈉(10μmol/L)對照組。空白對照組給予正常DMEM，溶媒對照組給予含0．1%DMSO的DMEM。上述各組再分為不加胰島素處理和加胰島素處理(20 nmol/L)。藥物作用48 h后，分別用葡萄糖氧化酶法檢測細胞上清液中葡萄糖含量、比色法檢測游離脂肪酸(free fat acid，FFA)的濃度。FFA抑制率(%)=(空白對照組FFA含量－實驗組FFA含量)/空白對照組FFA含量×100%。

2．6 ELISA法測定脂聯素分泌 將建模成功的胰島素抵抗脂肪細胞分為溶媒對照組(給予含0．1%DMSO的DMEM)、積雪草酸(10、30和100μmol/L)處理組、羅格列酮對照組和正釩酸鈉對照組。此外，取分化成熟的正常脂肪細胞另設為正常對照組(control)，其不做任何處理。其它各組藥物作用48 h后，按試劑盒ELISA法檢測脂聯素含量。

2．7 Western blotting法測定過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptorγ，PPARγ)和蛋白酪氨酸磷酸酶1B(protein tyrosine phosphatase 1B，PTP1B)蛋白表達 收集藥物處理后的細胞，棄去培養液，用冰PBS清洗3次，加入150 μL含PMSF的RIPA裂解液，于冰上裂解10 min，將細胞刮下收集到EP管中。12 000×g、4℃離心10 min，取上清，通過Bio-Rad蛋白實驗進行總蛋白定量。以10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白，然后濕轉法(200 mA、1．5 h)將蛋白轉移到硝酸纖維膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后。加Ⅰ抗孵育4℃過夜，PBST清洗3次后加Ⅱ抗，37℃孵育1 h，PBST洗3次后，加入ECL化學發光試劑增強反應，X線壓片曝光，采用WO-9413B型凝膠成像系統自帶軟件Gelpro32來分析膠片中的蛋白條帶。

3 統計學處理

數據以均數±標準差(mean±SD)表示。采用SPSS19．0軟件進行統計分析，兩組比較采用t檢驗，多組比較采用方差分析(One-way ANOVA)，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 積雪草酸對3T3-L1前脂肪細胞增殖、分化的影響

與溶媒對照組相比，積雪草酸在濃度10～100 μmol/L時能顯著促進3T3-L1前脂肪細胞增殖(P＜0.05或P＜0.01)，在濃度100μmol/L時其增殖提高率達24．1%;同時，明顯抑制3T3-L1前脂肪細胞的分化(P＜0.05或P＜0.01)。陽性對照藥羅格列酮和正釩酸鈉的結果則表現為在顯著促進3T3-L1前脂肪細胞增殖的同時促進其分化(P＜0.01)，見表1。

表1 積雪草酸對3T3-L1前脂肪細胞增殖和分化的影響Table 1．Effects of asiatic acid on the proliferation and differentiation in 3T3-L1 preadipocytes(Mean±SD．n=6)

2 胰島素抵抗脂肪細胞模型的建立

在地塞米松作用下，脂肪細胞對培養基中葡萄糖的攝取減少，導致模型組的葡萄糖消耗率比溶媒對照組明顯減少(減少44．2%，P＜0.01)，說明胰島素抵抗的脂肪細胞模型建立成功，見圖1。

Figure 1．The changes of glucose uptake in insulin-resistant adipocytes．Mean ± SD．n=6．＊＊ P ＜ 0.01 vs medium group．圖1 胰島素抵抗脂肪細胞的葡萄糖攝取情況

3 積雪草酸對胰島素抵抗脂肪細胞葡萄糖消耗和游離脂肪酸產生的影響

與溶媒對照組相比，無論在基礎狀態還是胰島素刺激狀態，積雪草酸在濃度30μmol/L和100 μmol/L時均顯著促進胰島素抵抗脂肪細胞葡萄糖的消耗(P＜0.05);同時，其顯著減少胰島素抵抗細胞游離脂肪酸的產生，與溶媒組比較差異顯著(P＜0.05)。陽性對照藥羅格列酮和正釩酸鈉的結果與積雪草酸相似，均顯著促進胰島素抵抗脂肪細胞葡萄糖的消耗，減少游離脂肪酸的產生(P＜0.01)，見表2。

表2 積雪草酸對胰島素抵抗脂肪細胞葡萄糖消耗和游離脂肪酸產生的影響Table 2．Effects of asiatic acid on glucose uptake and FFA production in insulin-resistant adipocytes(Mean±SD．n=6)

4 積雪草酸對胰島素抵抗脂肪細胞脂聯素分泌的影響

脂肪細胞發生胰島素抵抗后，其脂聯素分泌較正常對照組顯著減少(P＜0.01);與溶媒對照組相比，羅格列酮能顯著增加胰島素抵抗脂肪細胞的脂聯素分泌(P＜0.01);而積雪草酸和正釩酸鈉對胰島素抵抗脂肪細胞脂聯素分泌則無明顯升高作用(P＞0.05)，見表3。

表3 積雪草酸對胰島素抵抗脂肪細胞脂聯素分泌的影響Table 3．Effects of asiatic acid on adiponectin secretion in insulin-resistant adipocytes(Mean±SD．n=6)

5 積雪草酸對胰島素抵抗脂肪細胞的PPARγ和PTP1B蛋白表達的影響

藥物作用48 h后，與溶媒對照組相比，積雪草酸和正釩酸鈉對PPARγ蛋白表達無明顯影響(P＞0.05)，但能顯著下調胰島素抵抗脂肪細胞PTP1B蛋白的表達(P＜0.05或P＜0.01)。羅格列酮則相反，其能顯著上調胰島素抵抗脂肪細胞PPARγ蛋白表達(P＜0.01)，但對PTP1B蛋白表達則無明顯影響(P ＞0.05)，見圖2、3和表4。

Figure 2．Effects of asiatic acid on the expression of PPARγ in insulin-resistant adipocytes．1:medium group;2 ～ 4:asiatic acid(10，30 and 100 μmol/L)groups，respectively;5:Ros(10μmol/L)group;6:Van(10 μmol/L)group．圖2 積雪草酸對胰島素抵抗脂肪細胞的PPARγ蛋白表達的影響

Figure 3．Effects of asiatic acid on the expression of PTP1B in insulin-resistant adipocytes．1:medium group;2 ～4:asiatic acid(10，30 and 100 μmol/L)groups，respectively;5:Van(10μmol/L)group;6:Ros(10 μmol/L)group．圖3 積雪草酸對胰島素抵抗脂肪細胞的PTP1B蛋白表達的影響

表4 積雪草酸對胰島素抵抗脂肪細胞的PPARγ和PTP1B蛋白表達的影響Table 4．Effects of asiatic acid on the expression of PPARγ and PTP1B in insulin-resistant adipocytes(Mean±SD．n=6)

討 論

胰島素抵抗是2型糖尿病重要的發病機制之一，貫穿2型糖尿病的發生、發展全過程［4］。脂肪組織是胰島素作用的主要靶組織，其糖脂代謝異常在胰島素抵抗的發生發展中起重要作用［5］。正常情況下白色脂肪組織以脂肪的形式儲存過量能量，一旦能量攝取持續超過能量消耗時，脂肪組織不僅體積擴增肥大，而且脂肪細胞數量增多。肥大的脂肪細胞會分泌多種脂肪因子，如腫瘤壞死因子α、瘦素、抵抗素、脂聯素等以直接干預胰島素信號轉導。而過度分泌的FFA及某些脂肪因子可以進一步影響其它組織對胰島素的敏感性，也對胰島β細胞產生毒性，影響其胰島素的合成和分泌，加重糖脂代謝的紊亂。

3T3-L1前脂肪細胞系在胰島素、地塞米松和3-異丁基-1-甲基黃嘌呤的刺激下，具有分化為成熟脂肪細胞的能力，是目前國際上研究胰島素抵抗、肥胖及體外脂肪細胞分化的常用工具［6］。為此，本實驗選用地塞米松誘導3T3-L1脂肪細胞建立胰島素抵抗模型，發現積雪草酸顯著增加胰島素抵抗脂肪細胞葡萄糖的消耗和減少游離脂肪酸的產生，表明積雪草酸對胰島素抵抗具有明顯的改善作用。

PPARγ是一種在脂肪組織發育和功能中起重要作用的轉錄因子。激活PPARγ能促進前脂肪細胞增殖和分化，增加對胰島素敏感的小脂肪細胞的數量，減少游離脂肪酸的產生，提高脂肪細胞胰島素敏感性，并最終改善胰島素抵抗。以PPARγ為靶點的噻唑烷二酮類藥物(如羅格列酮)早已作為胰島素增敏劑被廣泛應用。脂聯素作為近年發現的脂肪細胞因子之一受到廣泛關注，具有改善糖脂代謝、增加機體胰島素敏感性，改善胰島素抵抗等作用［7］。本實驗發現，積雪草酸促進前脂肪細胞增殖，增加胰島素抵抗脂肪細胞葡萄糖利用，降低游離脂肪酸產生，該結果與羅格列酮相似。但是，對前脂肪細胞分化的影響則相反，羅格列酮表現為促進，而積雪草酸則表現為抑制作用。此外，羅格列酮能明顯增加胰島素抵抗脂肪細胞的脂聯素水平，但積雪草酸和正釩酸鈉則未有此作用。由此我們分析推測，積雪草酸改善胰島素抵抗的作用機制可能不同于羅格列酮。

胰島素抵抗可以發生在胰島素信號轉導過程中的多個環節。蛋白酪氨酸磷酸酶在胰島素作用的信號轉導途徑中起到重要的負調節作用，其中PTP1B的作用尤其顯著。PTP1B主要分布于細胞漿內，胰島素與受體結合后，促使胰島素受體β亞單位和胰島素受體底物1的磷酸酪氨酸殘基去磷酸化，負性調節胰島素信號轉導下調［8-9］。越來越多的證據表明:PTP1B通過去磷酸化作用影響了胰島素信號轉導，對胰島素抵抗和肥胖的發生起重要作用［10-11］。PTP1B抑制劑可抑制胰島素受體的去磷酸化，從而延長和擴大胰島素關鍵性早期信號的轉導。因此，尋找高效特異性的PTP1B抑制劑為治療2型糖尿病和肥胖開辟了新的途徑。正釩酸鈉是公認的PTP1B抑制劑，故本實驗選擇它作為陽性對照藥之一，結果發現積雪草酸與正釩酸鈉作用相似，在提高胰島素抵抗脂肪細胞的葡萄糖利用、減少游離脂肪酸產生的同時，對胰島素抵抗脂肪細胞的脂聯素分泌以及PPARγ蛋白表達無明顯影響，但可下調PTP1B蛋白表達。因此，我們推測，下調胰島素信號轉導的負性調節因子PTP1B，促進胰島素信號轉導，可能是積雪草酸改善胰島素抵抗的主要機制。