亞低溫減輕氧糖剝奪所致的大鼠海馬神經元損傷*

周天恩， 張 萌， 楊正飛， 蔣龍元

目前在臨床上亞低溫(31～32℃)已廣泛用于治療缺血、缺氧性腦病。亞低溫可通過降低腦組織氧耗量，抑制氧自由基生成和釋放以及抑制腦缺血缺氧后的炎性反應對中樞神經系統起保護作用，但其保護作用的分子機制尚不明確。近來有研究發現［1-2］，亞低溫可通過減少神經元凋亡從而改善缺血、缺氧性腦病的神經功能。細胞凋亡與caspase蛋白酶家族密切相關，所以亞低溫神經保護作用的機制可能與 caspase蛋白酶家族相關。Caspase-3是caspase蛋白酶家族的重要成員之一，是執行凋亡的重要效應分子，本實驗擬研究caspase-3在亞低溫減輕大鼠海馬神經元氧糖剝奪(oxygen-glucose deprivation，OGD)損傷中的作用。

材料和方法

1 材料

1.1 動物 SPF級健康新生(1～3 d)Sprague-Dawley(SD)大鼠，雌雄不限，由中山大學北校區實驗動物中心提供。動物生產許可證號為SCXK(粵)2011-0029。將新生乳鼠消毒后剪開頭皮與顱骨，分離取出海馬組織。

1.2 主要儀器 Galaxy A三氣培養箱 (RS Biotech);倒置熒光相差顯微鏡T2000U(Nikon);電子顯微鏡(中山大學北校區電子顯微鏡室);全自動酶標儀(Dragon);7600-010全自動生化分析儀 (Hitachi);流式細胞儀 Facscalibur(Becton Dickinson);Anke TDL-40B高速離心機(上海安亭);低溫離心機(Eppendorf)。

1.3 主要試劑 DMEM/F12培養基 (Gibco);胎牛血清(HyClone);B27(Invitrogen);多聚賴氨酸(Sigma);阿糖胞苷(上海華聯公司);Triton X-100(Amresco);兔抗微管相關蛋白2(microtubule-associated protein 2，MAP2)多克隆抗體(Chemicon);山羊抗兔Cy3連接Ⅱ抗(Chemicon);Hoechst 33258(Sigma);臺盼藍(武漢博士德);胰蛋白酶(Sigma);碘化丙啶(propidium iodide，PI;Sigma);Annexin V-FITC 凋亡檢測試劑盒(Bender Medsystems);蛋白裂解液(Cell Signaling);caspase-3比色測定試劑盒(Biovision);PBS 液(自配):取 NaCl 8.00 g，KCl 0.20 g，Na2HPO4·H2O 1.56 g，KH2PO40.20 g，溶于三蒸水中，充分攪拌溶解后，加水至1 000 mL，調節pH值7.4，微孔濾器過濾除菌;無糖Earle's液(自配):取NaCl 6.80 g，KCl 0.40 g，CaCl20.20 g，MgSO4·7H2O 0.20 g，NaH2PO4·2H2O 1.14 g，NaHCO32.20 g，溶于三蒸水，攪拌溶解，加水至1 000 mL，調節 pH 值7.4，微孔濾器過濾除菌。

2 方法

2.1 細胞培養 0.1 g/L多聚賴氨酸包被培養皿3 d。取出生1～3 d SD乳鼠，消毒皮膚，依次剪開頭皮與顱骨，迅速取出腦組織置于含4℃ PBS的培養皿。顯微鏡下分離海馬組織，放入含DMEM/F12培養基的離心管中輕柔吹打，以1 500 r/min離心5 min，棄上清液，加入含10%胎牛血清的DMEM/F12重懸細胞。臺盼藍計數活細胞數量，以1×109/L密度將細胞接種于培養皿，置入37℃、5%CO2培養箱孵育。24 h后全量更換含2%B27的培養基，第3天加入5 μmol/L阿糖胞苷作用24 h，以后每3 d全量換液。觀察神經元的生長及細胞形態，第8天行神經元MAP2免疫化學熒光鑒定。

2.2 實驗分組及模型的建立 將實驗細胞隨機分為4組(n=6):即為正常對照組、單純亞低溫組、單純OGD組和亞低溫+OGD組。通過設置培養箱溫度控制參數將亞低溫組培養箱內溫度自動控制在31～32℃。調設三氣培養箱至缺氧狀態(37℃，0.1%O2，5%CO2，94.5%N2)，以此模擬細胞缺氧。將培養第8天的海馬神經元取出，吸出培養基，加入無糖Earle's液2 mL，以此模擬神經元缺糖。本實驗OGD時間為2 h，OGD后復氧、復糖24 h后處理送檢，非OGD組與OGD組同時處理送檢。

2.3 形態學觀察 將各組細胞復氧復糖24 h后，去除細胞培養液，固定15 min，用細胞刮子將細胞刮下，以2 000～3 000 r/min的速度低溫離心10 min，使細胞在離心管尖沉淀結塊。4℃保存送電子顯微鏡室觀察。

2.4 流式細胞術檢測神經元凋亡 取各組細胞，復糖復氧24 h。胰酶消化后收集細胞離心，棄上清液，用結合緩沖液重懸細胞，加入Annexin V-FITC和PI，混勻后避光室溫反應15 min，流式細胞儀檢測凋亡率。凋亡率=早期凋亡率+中晚期凋亡率。

2.5 神經元胞漿內caspase-3活性檢測 提取細胞漿內總蛋白，測定caspase-3的實際濃度，取200 μg caspase-3蛋白按caspase-3比色測定試劑盒要求處理，此后選擇405 nm波長，在酶標儀上測定各孔吸光度值。Caspase活性升高倍數=實驗組A值/正常對照組A值。

3 統計學處理

計量資料用均數±標準差(mean±SD)表示，樣本均數間的比較采用方差分析，并行方差齊性檢驗，兩組數據之間的相關研究采用直線相關分析。采用SPSS 13.0統計軟件完成，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 大鼠海馬神經元培養與鑒定結果

培養第8天的大鼠海馬神經元經MAP2免疫熒光染色后置于熒光顯微鏡下用綠光激發，神經元胞漿及軸突顯紅色熒光，膠質細胞的胞漿及軸突和所有細胞核不染色，見圖1A;同時用Hoechst 33258進行的非特異性細胞核熒光染色，所有細胞核(包括膠質細胞核)染藍色，見圖1B。同一個視野2種染色結果比較后顯示海馬神經元占所培養細胞的90%以上。

Figure 1.Fluorescence microscopic images(×200).A:immunofluorescence staining of microtubule-associated protein 2(MAP2)in rat hippocampal neurons;B:Hoechst 33258 fluorescence staining of nuclei in all isolated cells.圖1 MAP2免疫熒光染色及Hoechst 33258非特異性細胞核熒光染色結果

2 亞低溫減輕OGD所致海馬神經元形態學損傷并

降低神經元的凋亡率

各組海馬神經元氧糖剝奪/復氧復糖培養24 h后分別用倒置光學顯微鏡和電子顯微鏡進行形態學觀察，結果顯示，神經元OGD后出現了胞體腫脹、包膜不完整、細胞器破壞等損傷表現，亞低溫干預后細胞損傷程度明顯減輕，見圖2、3。流式細胞術結果顯示，單純亞低溫組的神經元凋亡率(12.5% ±2.4%)與正常對照組神經元凋亡率(14.2% ±2.9%)比較無統計學差異;神經細胞OGD后凋亡率明顯升高，單純OGD組神經元凋亡率(42.9% ±4.3%)與亞低溫+OGD組神經元凋亡率(28.3% ±3.2%)均明顯高于正常對照組(P＜0.01);亞低溫+OGD組與單純OGD組比較，神經元凋亡率下降，且差異有統計學意義(P ＜0.05)，見圖4。

Figure 2.The morphology of rat hippocampal neurons 24 h after reoxygenation and glucose reintroduction observed under light microscope(×400).A:control group;B:mild hypothermia group;C:OGD group;D:mild hypothermia+OGD group.圖2 各組大鼠海馬神經元復氧復糖24 h后的形態學變化

Figure 3.The ultrastructure of rat hippocampal neurons 24 h after reoxygenation and glucose reintroduction observed under electron microscope(×15 500～21 000).A:control group;B:mild hypothermia group;C:OGD group;D:mild hypothermia+OGD group.圖3 各組大鼠海馬神經元復氧復糖24 h后超微結構的變化

3 亞低溫降低神經元凋亡率的同時降低神經元胞漿內caspase-3活性

單純亞低溫組caspase-3活性(121% ±17%)與正常對照組caspase-3活性(100% ±14%)比較無顯著差異;神經細胞OGD后caspase-3活性明顯升高，單純OGD組caspase-3活性(353% ±31%)和亞低溫+OGD組caspase-3活性(225% ±24%)均明顯高于正常對照組(P＜0.01);亞低溫+OGD組與單純OGD組比較，caspase-3活性下降，且差異均有統計學意義(P ＜0.05)，見圖5。

4 OGD后神經元凋亡率與神經元胞漿內caspase-3活性的相關性分析結果

OGD 2 h后神經元凋亡率(42.9% ±4.3%)與神經元胞漿內caspase-3活性(353% ±31%)呈顯著正相關(r=0.823，P ＜0.05);亞低溫 +OGD 2 h 后神經元凋亡率(28.3% ±3.2%)與神經元胞漿內caspase-3活性(225% ±24%)亦呈顯著正相關(r=0.841，P ＜0.05)。

Figure 4.The apoptosis of rat hippocampal neurons detected by flow cytometry.A:control group;B:mild hypothermia group;C:OGD group;D:mild hypothermia+OGD group.Mean ±SD.n=6.＊＊P ＜0.01 vs control group;#P ＜0.05 vs OGD group.圖4 流式細胞術檢測各組大鼠海馬神經元的凋亡

Figure 5.Comparison of caspase-3 activity in the cytoplasm of rat hippocampal neurons.Mean ± SD.n=6.＊＊P ＜0.01 vs control group;#P ＜0.05 vs OGD group.圖5 各組大鼠海馬神經元胞漿內caspase-3活性比較

討 論

1 神經元OGD損傷模型的方法學評價

體外培養的神經細胞保留了體內神經元的相關生理特性，目前已被廣泛培養用來代替體內神經細胞進行實驗研究［3-6］。體外OGD模型與體內模型相比，其能更簡單、更準確地控制細胞外環境，因此常用來研究缺血、缺氧引起的生物化學及細胞形態學改變，亦常用來研究相關的分子生物學機制［7］。目前用OGD模型模擬體內神經元缺血、缺氧是研究的熱點，此模型目前已被廣泛用來研究缺血、缺氧性腦病［8-11］。

2 亞低溫對OGD損傷神經元的保護作用

目前亞低溫仍是腦缺血、缺氧損傷后治療的關鍵。在臨床研究方面，Yokoyama等［12］在日本進行了一個多中心調查研究發現，452個心肺復蘇后恢復自主循環的患者均接受了亞低溫治療，中心體溫控制在(33.9 ±0.4)℃，持續時間(31.5 ±13.9)h，結果發現30 d后存活率為80.1%，具有良好神經功能的比例有55.3%，這明顯高于既往報道的未接受低溫治療的患者。在大體動物研究方面，有學者研究發現［13］，在失血性休克大鼠模型中，33℃的亞低溫治療能明顯提高生存率。Noguchi等［14］在沙鼠全腦缺血模型中研究發現，亞低溫可抑制缺血/再灌注損傷及細動脈血管收縮，從而改善全腦缺血損傷的存活率。在體外培養的動物神經細胞方面，Dalen等［15］在體外培養的神經細胞OGD模型中研究發現，亞低溫能明顯提高神經元OGD后的存活率并減少炎癥介質的生成，且其保護作用與復氧后氧濃度的高低無關。Liu等［16］在體外培養的大鼠腦切片OGD模型中研究發現，亞低溫能改善細胞的新陳代謝，且低溫時機越早越好。

本研究發現，亞低溫干預能明顯減輕OGD導致的神經元損傷，包括改善神經元的形態，以及降低神經元的凋亡率。但是亞低溫具有潛在的副作用，其具體溫度的控制和亞低溫治療的時間仍需要更進一步的研究。

3 亞低溫對OGD損傷神經元保護的分子機制

亞低溫可通過減少神經元凋亡從而改善缺血、缺氧性腦病的神經功能，而細胞凋亡與caspase家族密切相關。Caspase是一個半胱氨酸蛋白酶家族，在細胞凋亡的過程中起著關鍵性的作用，是凋亡的共同通路，其成員是caspase-3執行凋亡的重要效應分子，激活caspase-3之前稱為凋亡的可逆階段，之后稱為凋亡的不可逆階段。因此，降低caspase-3的活性可以有效抑制凋亡的發生發展。由于caspase-3與凋亡有密切的相關性，很多學者已將caspase-3作為檢測指標，用來評估某方法或藥物對大腦缺血、缺氧性損傷的治療效果［17-20］。有研究表明，亞低溫可抑制缺血再灌注損傷引起的 caspase-3活化［21］，可降低H2O2誘導的心肌細胞損傷中的 caspase-3活性［22］，還可減少缺血、缺氧性腦病新生兒血清中的caspase-3活性［23］。因此，亞低溫治療可能是通過降低缺氧缺血后caspase-3的活性，從而起到腦保護作用。

本研究發現，神經細胞OGD后caspase-3活性明顯升高，與神經元凋亡率升高呈正相關，這說明神經細胞OGD后可能通過激活caspase-3，從而引發神經元程序性死亡，導致凋亡明顯增加;亞低溫+OGD組與單純OGD組比較，caspase-3活性下降，同時神經元凋亡率亦明顯下降，說明亞低溫可能通過降低caspase-3活性從而抑制神經元的凋亡。本實驗結果表明，降低caspase-3活性是亞低溫對神經元OGD損傷保護作用的分子機制之一。亞低溫對OGD損傷的保護作用的分子機制極其復雜，目前尚未完全明了，需要進一步研究。

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