益氣活血方和補腎生髓方對腦缺血再灌注大鼠Notch3和Frizzled2 mRNA及蛋白表達的影響*

呂 磊，胡建鵬，王 鍵， 徐 偉，譚 輝， 張紅梅，王麗娜， 何 玲

近年來，神經干細胞(neural stem cells，NSCs)在缺血性腦卒中中的修復作用已引起廣泛關注［1］。隨著近年分子生物學技術的發展和對干細胞研究的深入，使干細胞增殖分化信號途徑與調控迅速成為揭示干細胞增殖分化分子機制的前沿課題。近年來研究表明Notch信號通路通過“旁側抑制”機制對NSCs自我更新、增殖和分化進行調節［2］。益氣活血法和補腎生髓法是中醫臨床上治療缺血性腦卒中常用方法。以往我們的研究已證實益氣活血方能促進和調節局灶性腦缺血后內源性神經干細胞的增殖分化，補腎生髓法及其代表復方具有促進腦缺血后突觸重塑和神經細胞軸突的再生作用［3-5］。本實驗采用線栓法大腦中動脈制作局灶性腦缺血再灌注大鼠模型，觀察益氣活血方和補腎生髓方對模型大鼠缺血側額頂葉皮質或海馬CA1區Notch3和Frizzled2 mRNA及蛋白表達的影響，探討其對腦缺血損傷后內源性NSCs增殖分化的影響及其作用機制。

材料和方法

1 材料

1.1 動物 健康SD大鼠32只，南京醫科大學實驗動物中心提供，許可證號為SCXK(蘇)2002-0031，雌雄各半，月齡4個月，體重(280～320)g。

1.2 試劑及儀器 Notch通路PCR芯片購自SABiosciences，Notch3和Frizzled2單克隆抗體、EnVision兩步法試劑盒、DAB顯色試劑盒購自北京中衫金橋公司。ND-1000型微量紫外可見分光光度計為Thermo產品，ABI PRISM 7700 system為美國應用生物系統公司產品，VANOX顯微鏡為Olympus產品，JD-801形態學顯微圖像分析系統為南京捷達科技發展有限公司產品。

1.3 藥物 益氣活血方(腦絡欣通):黃芪30 g，三七10 g，川芎10 g，紅花6 g。補腎生髓方:龜板膠10 g，鹿角膠10 g，金毛狗脊10 g，杜仲10 g。由安徽中醫藥大學中藥制劑室制備，分別相當于原生藥6.0 kg/L 和2.4 kg/L。

2 方法

2.1 動物分組與給藥 隨機分為假手術(sham)組、缺血再灌注(ischemia reperfusion，IR)組、益氣活血方(Yiqi-Huoxue prescription，IR+Y)組和補腎生髓方(Bushen-Shengsui prescription，IR+B)組，每組11只。益氣活血方和補腎生髓方取中等劑量(分別為8.54 g/kg和10.25 g/kg)。復制局灶性腦缺血前30 min給藥1次，以后每天灌胃2次。Sham組和IR組按同樣方法予以等量的生理鹽水灌胃，均持續1周。

2.2 腦缺血再灌注模型復制與神經功能障礙評分

采用改良的Longa法［6］制備大鼠大腦中動脈線栓塞模型及進行神經功能缺損體征評分。在腦缺血2 h再灌注時進行評分，2～3分者入選，假手術組僅進行動脈分離。

2.3 取材 分別于腦缺血2 h、再灌注1周后，10%水合氯醛(3.6 mL/kg，ip)麻醉大鼠，每組取3只大鼠，迅速開顱取腦，在冰凍生理鹽水中，取缺血側額頂葉皮質，-80℃冰箱備用，用于實時熒光定量PCR檢測。每組取8只大鼠，打開胸腔，于右心耳部剪一小口，從左心室插入導管至主動脈，向內快速注入37℃肝素化生理鹽水200 mL，至右心耳流出液變清亮，然后注入4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液250 mL，灌流固定30 min后斷頭取腦，除去小腦和腦干，取大腦，放入相同的固定液中固定1周，脫水、透明、浸蠟，石蠟包埋，從視交叉后2～3 mm左右在有海馬區域做連續冠狀切片，切片厚度5 μm，用于免疫組化染色。

2.4 Notch3和Frizzled2 mRNA和蛋白表達的檢測2.4.1 Notch信號通路基因芯片PCR Assay 嚴格按照操作規程進行，主要包括:腦組織額頂葉皮質RNA抽提，DNase I消化RNA樣品(去除其中可能含有的基因組DNA)，RNA純化，紫外吸收測定法檢測RNA質量(濃度、純度)，cDNA合成，實時熒光定量PCR檢測Notch3和Frizzled2 mRNA表達水平。

2.4.2 免疫組化染色 采用EnVision兩步法進行免疫組化染色，DAB顯色液顯色，Notch3和Frizzled2抗體稀釋濃度為1∶100，陰性對照采用正常山羊血清替代I抗進行，蘇木素輕度復染。

3 統計學處理

數據經SPSS 11.0軟件處理，Notch信號通路基因芯片PCR Assay檢測結果采用2-ΔΔCt法計算組間mRNA的表達差異，以上調或下調倍數 ＞1.5或＜-1.5為差異有統計學意義;免疫組化染色結果的處理采用南京捷達JD-801圖像分析系統，在相同視野下對Notch3和Frizzled2免疫反應陽性細胞積分吸光度(integral absorbance，IA)進行分析，數據用均數±標準差(mean±SD)表示，組間均數比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 2種中藥復方對腦缺血再灌注模型大鼠額頂葉皮質Notch3和Frizzled2 mRNA表達的影響

Notch信號通路基因芯片PCR Assay檢測結果顯示，與sham組比較，IR組Frizzled2 mRNA表達顯著增高(P＜0.05)，Notch3 mRNA 表達無顯著差異(P＞0.05);與IR組比較，益氣活血方組Frizzled2 mRNA表達無顯著差異(P＞0.05)，Notch3 mRNA表達顯著增高(P＜0.05);與IR組比較，補腎生髓方組Frizzled2 mRNA表達顯著降低(P＜0.05)，Notch3 mRNA無顯著差異(P＞0.05);與益氣活血方組比較，補腎生髓方組Frizzled2 mRNA表達顯著降低(P＜0.05)，Notch3 mRNA無顯著差異(P＞0.05)，見表1。

2 2種中藥復方對腦缺血再灌注模型大鼠海馬CA1區Notch3和Frizzled2蛋白表達的影響

陰性對照組未見Notch3和Frizzled2蛋白表達;sham組動脈分離側海馬CA1區可見Notch3和Frizzled2蛋白明顯表達。IR組Notch3蛋白表達明顯增強，主要表達于神經細胞胞核，其IA值顯著高于sham組(P＜0.05);兩中藥復方組海馬 CA1區Notch3蛋白表達增加，其IA值均顯著高于IR組(P＜0.05)，補腎生髓方組IA值顯著高于益氣活血方組(P＜0.05)。IR組Frizzled2蛋白表達明顯增強，主要表達于神經細胞胞核和胞漿，其IA值顯著高于sham組(P＜0.05);兩中藥復方組海馬CA1區Frizzled2蛋白表達降低，其IA值均顯著低于IR組(P＜0.05)，但2 組之間無顯著差異(P ＞0.05)，見圖 1、2和表2。

表1 各組大鼠額葉皮質Notch3和Frizzled2 mRNA表達的變化Table 1.Changes of Notch3 and Frizzled2 mRNA expression in the cortex of frontal and parietal lobes of the rats in different groups(n=3)

Figure 1.The expression of Notch3 protein at 1 week in CA1 area of the hippocampus detected by EnVision two-step method(DAB，×400).A:negative control group;B:sham group;C:IR group;D:IR+Y group;E:IR+B group.Positive staining is brown.圖1 EnVision兩步法檢測海馬CA1區Notch3蛋白的表達

Figure 2.The expression of Frizzled2 protein at 1 week in CA1 area of the hippocampus detected by EnVision two-step method(DAB，×400).A:negative control group;B:sham group;C:IR group;D:IR+Y group;E:IR+B group.Positive staining is brown.圖2 EnVision兩步法檢測海馬CA1區Frizzled2蛋白的表達

表2 各組海馬CA1區Notch3和Frizzled2蛋白表達的積分吸光度值Table 2.Integral absorbance(IA)values of Notch3 and Frizzled2 positive cells in CA1 area of the hippocampus after local cerebral ischemia for 2 h followed by 1 week of reperfusion in different groups(mean±SD.n=8)

討 論

腦血管疾病是中老年人的常見病，以高發病率、高復發率、高致殘率、高死亡率為特點，已成為當前疾病三大死亡原因之一。本病以腦卒中為主，尤以缺血性腦卒中最為多見，且近年來呈上升趨勢，占卒中80%。卒中后智力障礙與肢體致殘是一嚴重的社會問題和醫學難題。研究促進大腦功能重組和神經再生及其調節機制，促進機體功能恢復，對于減少殘疾發生將是十分有意義的。

中醫藥在促進中風恢復期神經功能恢復、重建方面積累了一定的實踐經驗，取得了一些療效，但由于作用機制不明確，使得用藥缺乏規律性。益氣活血法、補腎生髓法是臨床治療缺血性腦中風常用治法。近年來研究證實，成年動物以及人的神經系統中都有NSCs的存在，但絕大部分在體內處于靜止狀態，在損傷等病理條件下可以被激活并增殖、遷移及分化，可能使損傷造成的形態及功能上的缺失得以恢復。缺血后內源性NSCs的激活在腦缺血修復和功能重建中發揮了積極的作用，為實現腦損傷后的自身修復帶來了希望。Notch信號轉導通路作為胚胎發育過程中十分重要的信號途徑，其相關分子的表達、運輸和降解等過程受到諸多因素的調節，除了配體-受體水平的調節之外，尚受到多種蛋白質的調節［7］。Notch信號家族包括Notch受體、配體及其相應的細胞內信號分子，Notch受體激活后誘導的信號轉導系統在調節NSCs的增殖分化中起到重要作用。體內研究表明，激活的 Notch受體能夠促進NSCs向星形膠質細胞分化，抑制其向神經元和少突膠質細胞分化［8］。近年來，隨著干細胞分化方面研究的逐步深入，逐漸認識到 Notch信號通路并非孤立存在的，而是處于一個復雜精細的信號網絡之中，與Wnt信號通路在分子水平上存在聯系，并且二者之間也存在串聯和互相調控，其中Frizzled2為兩者共同調控因子［9］。

本實驗研究發現局灶性腦缺血再灌注大鼠海馬Notch3和Frizzled2 mRNA及蛋白表達增加，說明局灶性腦缺血再灌注存在Notch信號通路變化。有研究表明，腦缺血后可以引起海馬CA1區神經干細胞增殖，同時伴隨著Notch信號通路被激活，抑制Notch信號途徑可以增加神經元的數目［10］。益氣活血方和補腎生髓方防治組多能增強Notch3 mRNA及蛋白表達，降低Frizzled2 mRNA及蛋白表達。但2中藥復方也存在差異，在降低Frizzled2 mRNA表達和增強Notch3蛋白表達方面，補腎生髓方比益氣活血方明顯。以往我們的研究已證實益氣活血方能促進大鼠局灶性腦缺血后內源性神經干細胞的增殖分化，補腎生髓方具有促進腦缺血后突觸重塑和神經細胞軸突的再生作用［3，5］，因此認為2種中藥復方能通過促進Notch信號通路Notch3 mRNA及蛋白表達，抑制Frizzled2 mRNA及蛋白表達，進而影響局灶性腦缺血后NSCs增殖分化及神經可塑性，促進腦損傷康復，但Notch信號轉導途徑的激活對NSCs增殖與分化及神經可塑性結果的影響尚有待于進一步研究。

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［5］ 江愛娟，胡建鵬，王 鍵，等.益氣活血方和補腎生髓方對大鼠腦缺血恢復期GAP-43和SYP表達的影響［J］.中國中醫藥科技，2008，15(6):418-420.

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