SNS-032誘導彌漫性大B淋巴瘤OCI-LY-19細胞株凋亡及其作用機制的研究*

師憲平， 藍曉瑩， 溫創宇， 陳 鑫， 劉煥亮， 黃美近

非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma，NHL)是目前發病率增長最快的惡性腫瘤，其中彌漫性大B淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL)是最常見的NHL。DLBCL是大B型淋巴細胞彌漫性惡性增生性疾病，在最近的10～20年間發病率逐漸增加。DLBCL在西方國家占成人非霍奇金淋巴瘤30%～40%，在發展中國家高達60%。按照腫瘤細胞來源和臨床表現DLBCL分為生發中心B細胞樣彌漫性大B細胞淋巴瘤(germinal center B cell-like diffuse large B-cell lymphoma，GCB-DLBCL)、活化性B細胞樣彌漫性大B細胞淋巴瘤(activated B celllike diffuse large B-cell lymphoma，ABC-DLBCL)和原發性縱膈B細胞淋巴瘤(primary mediastinal B-cell lymphoma，PMBL)3型。迄今，利妥昔單抗聯合CHOP方案(rituximab plus CHOP，R-CHOP;利妥昔單抗聯合環磷酰胺、阿霉素、長春新堿和強的松)被國際上公認為治療侵襲性NHL的經典療法，在治療低度惡性NHL特別是GCB型DLBCL取得了良好的效果。然而在用藥過程中產生了極大的耐藥復發問題及并發癥(支氣管痙攣、心律失常、肝功能衰竭、呼吸困難等)，嚴重影響了治療效果［1］，迫切需要篩選出作用機制各異的有效化合物治療DLBCL。

SNS-032(BMS-387032)是一種新型的氨噻唑化合物，因其對細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶(cyclindependent kinase，CDK)的活性具有抑制作用，最初被定義為 CDK2、7、9 的抑制劑［2］。已有報道證明SNS-032可用于多種腫瘤，如急性粒細胞性白血病(acute myelogenous leukemia，AML)［3］、慢性淋巴性白血病(chronic lymphocytic leukemia，CLL)［4］、多發性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)、結腸癌、非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)等［5-6］的治療，目前該化合物已處于CLL、MM及其轉移性難治性實體瘤的I期臨床試驗階段。本研究以GCB-DLBCL細胞株OCI-LY-19為研究對象，觀察SNS-032對OCI-LY-19細胞的抗腫瘤活性，并分析其可能的作用機制，以期探討該化合物在彌漫性大B淋巴瘤治療中的潛在應用價值。

材料和方法

1 材料

OCI-LY-19細胞株購自中國醫學科學院血液學研究所。胎牛血清購自HyClone。RPMI-1640培養基購自Gibco。MTS購自Promega。碘化丙啶(propidium iodide，PI)和Annexin V細胞凋亡檢測試劑盒購自Sigma-Aldrich。抗聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶［poly(ADP-ribose)polymerase，PRAP］、含半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3、9前體(procaspase-3和procaspase-9)、含半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3、9切割體(cleaved caspase-3和 cleaved caspase-9)、蛋白絲/蘇氨酸激酶 (protein serine/threonine kinase，Akt)、p-Akt、細胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinases，ERK)和 p-ERK抗體為 Cell Signaling產品。抗髓樣細胞白血病1(myeloid cell leukemia-1，Mcl-1)、X連鎖凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP)、B細胞淋巴瘤2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde3-phosphatedehydrogenase，GAPDH)、信號轉導子及轉錄激活子5(signal transductor and activator of transcription 5，STAT5)和p-STAT5抗體購自Upstate Technology。HRP－抗鼠/兔 Ig抗體為Pierce Biotechnology產品。

2 主要方法

2.1 細胞培養與加藥 OCI-LY-19細胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液(含1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素)，于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養，實驗所用的細胞均處于對數生長期。實驗所用的SNS-032由DMSO溶解，貯存濃度為20 mmol/L。加藥時用滅菌的PBS將SNS-032稀釋至一定濃度，計算加藥的體積，確保每組中DMSO的量一致(DMSO的終濃度控制在0.1%以下)。實驗設計中所有的對照組(control，C)均加入與加藥組等比例的DMSO和PBS混合液。

2.2 細胞活力檢測實驗 用MTS法測細胞活力抑制情況，取生長良好的OCI-LY-19細胞，配成單細胞懸液，稀釋為2×108cells/L后，加至96孔板，對照組加入RPMI-1640培養基50 μL;實驗組每孔加入含SNS-032的培養基50 μL，使 SNS-032終濃度為0、0.08、0.16、0.31、0.63 和 1.25 μmol/L，每組 3 個重復孔。加入不同濃度SNS-032作用68 h后于實驗各孔分別加MTS試劑20 μL，37℃繼續孵育4 h，酶聯免疫檢測儀測定各孔的吸光度值(測定波長490 nm)，以濃度為橫坐標，細胞活力為縱坐標繪制SNS-032對OCI-LY-19細胞生長活力抑制的柱狀圖，用GraphPad Prism 4.0軟件計算半數抑制濃度(50%inhibitory concentration，IC50)。

2.3 PI單染細胞形態學檢測 OCI-LY-19細胞經0.5 μmol/L SNS-032 處理，5 h 后加入已過濾的 PI(1∶100)染液，多時點動態觀察，顯微鏡TRITC熒光通道拍照記錄PI陽性細胞(紅染細胞)。

2.4 Annexin V/PI雙標記法流式細胞術測定細胞凋亡 實驗按照Sigma-Aldrich公司提供的試劑說明書操作，重復3次，實驗設有不同藥物濃度組。收集細胞，1×binding buffer洗滌細胞后，Annexin V工作液100 μL室溫孵育 15 min，檢測前每管加 PI 1 μL上機。該法能區分正常細胞、早期凋亡細胞、晚期凋亡細胞及壞死細胞。在雙變量流式細胞儀的散點圖上，取右下象限和右上象限的總和(即Annexin V陽性細胞群)計為凋亡細胞。

2.5 Western blotting檢測 細胞密度調整至2×108cells/L，不同時點和不同濃度的SNS-032處理后收集細胞，加入蛋白裂解液RIPA(含蛋白酶抑制劑)充分裂解細胞提取蛋白，Bio-Rad蛋白濃度試劑盒紫外分光750 nm波長定量蛋白濃度。100～130 V恒壓電泳約90 min，100 V恒壓轉膜約90 min，5%牛奶室溫封閉1 h，I抗4℃過夜次日曝光。

3 統計學處理

用GraphPad Prism 4.0軟件對數據進行分析，數據用均數±標準差(mean±SD)表示，用單因素方差分析檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 SNS-032抑制OCI-LY-19細胞活力

用不同濃度的SNS-032處理OCI-LY-19細胞72 h后發現，當藥物濃度達到0.31 μmol/L時，藥物對細胞的生長活力出現了明顯的抑制(P＜0.05)。隨著藥物濃度增加，SNS-032對細胞活力的抑制就更加明顯，見圖1。經計算，SNS-032對OCI-LY-19細胞的IC50是 0.358 μmol/L。

Figure 1.Effect of SNS-032 on cell viability of DLBCL cell line OCI-LY-19.Mean ± SD.n=3.*P ＜ 0.05，＊＊P ＜0.01 vs control(0 μmol/L).圖1 SNS-032對彌漫性大B淋巴瘤細胞株OCI-LY-19活力的影響

2 SNS-032誘導OCI-LY-19細胞凋亡

0.5 μmol/L SNS-032 處理 OCI-LY-19 細胞后取6、12、26和36 h細胞分別進行PI單染并在熒光顯微鏡下觀察，如圖2所示，發現12 h后PI染色陽性細胞(紅染細胞)明顯增多(P＜0.05)，說明SNS-032明顯誘導了細胞死亡。圖3結果顯示，與空白組比較，0.25 μmol/L 組、0.5 μmol/L 組和 0.75 μmol/L組細胞凋亡比例(右下象限和右上象限的總和數)明顯增加，分別是7%、32%和52%，差異有統計學意義(P＜0.05)，這更進一步說明了SNS-032能明顯誘導OCI-LY-19細胞發生凋亡。

Figure 2.SNS-032(0.5 μmol/L)induced death of DLBCL cell line OCI-LY-19(PI staining，×100).圖2 SNS-032(0.5 μmol/L)誘導彌漫性大B淋巴瘤細胞株OCI-LY-19死亡

3 SNS-032對凋亡相關蛋白表達的影響

PARP切割呈SNS-032劑量與時間依賴性，procaspase-3、procaspase-9、XIAP與 Mcl-1 的表達隨藥物濃度和處理時間的增加而減少，cleaved caspase-3和cleaved caspase-9的表達明顯增多，Bcl-2沒有明顯變化，見圖4。這說明SNS-032能明顯增加 caspase-3與caspase-9前體的降解，誘導OCI-LY-19細胞凋亡，并且誘導細胞凋亡的通路與抑制XIAP和Mcl-1表達密切相關。

Figure 4.Effects of SNS-032 on the expression of apoptosis-related proteins PARP，procaspase-3，procaspase-9，cleaved caspase-3，cleaved caspase-9，XIAP，Mcl-1 and Bcl-2 in DLBCL cell line OCI-LY-19.Mean ± SD.n=3.*P ＜0.05，＊＊ P ＜0.01 vs control(0 μmol/L or 0 h).圖4 SNS-032對彌漫性大B淋巴瘤細胞株OCI-LY-19凋亡相關蛋白PARP、procaspase-3、procasepase-9、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、XIAP、Mcl-1和 Bcl-2表達的影響

4 SNS-032對增殖相關蛋白表達的抑制作用

SNS-032在OCI-LY-19細胞中呈濃度和時間依賴性地下調Akt和STAT5的總蛋白及其磷酸化蛋白表達，下調ERK的磷酸化水平，ERK總蛋白未見明顯變化，見圖5。

討 論

DLBCL是成人惡性淋巴瘤中最常見的一型，在形態學和臨床表現上都具有顯著的異質性，且細胞多藥耐藥基因顯著表達，傳統化療藥物治療后預后很差［1］，新型藥物的研發迫在眉睫。為此，我們選取了彌漫性大B淋巴瘤細胞株OCI-LY-19為研究對象，觀察小分子化合物SNS-032對其增殖與凋亡的影響。實驗結果顯示，SNS-032可通過切割PARP，下調XIAP和Mcl-1表達及激活caspase-3和caspase-9而誘導OCI-LY-19細胞凋亡，同時抑制了與細胞增殖相關的JAKs/STATs、MEK/ERK和PI3K-Akt信號轉導通路的表達與活化。據我們所知，這是首次發現SNS-032可以有效殺傷彌漫性大B淋巴瘤OCILY-19細胞。

Figure 5.Effects of SNS-032 on the expression of proliferation-related proteins Akt，p-Akt，ERK，p-ERK，STAT5 and p-STAT5 in DLBCL cell line OCI-LY-19.Mean ±SD.n=3.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control(0 μmol/L or 0 h).圖5 SNS-032對彌漫性大B淋巴瘤細胞株OCI-LY-19增殖相關蛋白Akt、p-Akt、ERK、p-ERK、STAT5和 p-STAT5表達的影響

已有報道證明小分子化合物SNS-032可用于多種腫瘤，如急性粒細胞性白血病［3］、慢性淋巴性白血病［4］、多發性骨髓瘤、腸癌、非小細胞肺癌等［5-6］的治療。國內外未見有關SNS-032作用于彌漫性大B淋巴瘤的報道，我們的研究顯示了SNS-032具有明顯的抗DLBCL作用。

實驗過程中我們觀察到SNS-032對能明顯抑制OCI-LY-19細胞生長并誘導OCI-LY-19細胞凋亡。首先，MTS法顯示，隨著藥物濃度增加，SNS-032對細胞的生長抑制率明顯增加;再者，加入0.5 μmol/L SNS-032后，PI染色細胞數目增多，提示死亡細胞增多，而Annexin V/PI雙標記流式細胞術檢測結果顯示用不同濃度SNS-032處理細胞24 h后，隨著藥物濃度增加，凋亡細胞增多;目前認為細胞凋亡的主要機制為caspase級聯反應，而caspase-9與 caspase-3在caspase級聯反應中分別在起始與執行上處于核心地位，是細胞凋亡發生的關鍵步驟。Caspase-9與caspase-3的活化意味著細胞凋亡［7］，為此，我們用Western blotting檢測了caspase-9與caspase-3前體procaspase-3與procaspase-9的表達情況，結果顯示兩者前體形式的表達均隨SNS-032濃度和時間的增大而減少，而具有DNA損傷修復作用且為caspase-3的底物PARP［8］也呈劑量與時間依賴性的增高而被切割，這都顯示了caspase級聯通路的活化。文獻報道，IAPs家族的XIAP、Bcl-2蛋白家族中的Mcl-1和Bcl-2在細胞中表達增多時，細胞抗凋亡功能增強［9-10］，從結果來看，雖然Bcl-2的表達沒有明顯變化，但XIAP和Mcl-1的表達均隨劑量與時間依賴性地增大而減少，細胞抗凋亡功能減弱。以上研究結果表明，SNS-032能誘導彌漫性大B淋巴瘤OCI-LY-19細胞的凋亡，其機制可能是抑制該類抗凋亡相關蛋白的表達，同時活化了caspase級聯反應。JAKs/STATs、MEK/ERK和PI3K-Akt信號轉導通路與細胞的增殖、分化及凋亡關系密切，這些通路異常活化可導致細胞異常增殖和惡性轉化［11-13］。為此，我們檢測這些通路中的關鍵蛋白Akt、STAT5、ERK的磷酸化形式及總蛋白的表達情況。結果顯示，該類蛋白的總體蛋白及磷酸化形式p-Akt、p-STAT5、p-ERK的表達隨SNS-032濃度和處理時間的增加而抑制，并且Akt與STAT5總蛋白的表達明顯下降，這提示SNS-032抑制 JAKs/STATs、MEK/ERK和 PI3K-Akt信號通路中關鍵蛋白的表達與活化，從而導致OCILY-19細胞增殖受到抑制。而這些通路是否與細胞凋亡相關基因的表達有關，并且通過什么樣的方式聯系，是我們今后需要進一步探討的科學問題。SNS-032為 CDK2、7、9的抑制劑，其中 CDK7和CDK9與RNA聚合酶II的磷酸化密切相關，SNS-032是否參與和OCI-LY-19細胞凋亡相關的基因，如XIAP和Mcl-1的轉錄調控過程，也是我們進一步要研究的關鍵問題。

總之，SNS-032通過抑制細胞抗凋亡相關蛋白的表達，抑制JAKs/STATs、MEK/ERK和 MEK/ERK信號轉導通路的表達與活化，從而明顯抑制彌漫性大B淋巴瘤OCI-LY-19細胞生長，誘導細胞凋亡，為臨床上彌漫性大B淋巴瘤的藥物治療提供了新的備選小分子化合物與新的思路。

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