4E-BP1在人腦膠質瘤細胞對卡氮芥獲得性耐藥中的作用*

朱慧麗， 翁澤平， 張繼君， 林琛蒞， 謝思明， 王 超， 馬繼偉， 鐘雪云△

腦膠質瘤是中樞神經系統最常見的惡性腫瘤，約占所有原發顱內腫瘤的40%［1］。由于腦膠質瘤復發率高，復發后大多惡性度增加，且產生耐藥性。一旦復發，再次接受手術的致殘、致死率極高，因此化、放療是復發后治療的主要手段［2］。耐藥性的產生是腦膠質瘤治療的最重要障礙之一。目前對耐藥的研究主要集中在膜轉運蛋白和DNA修復蛋白上，但針對其位點的藥物開發尚未取得明顯進展［3］。前期研究中本實驗室從人腦膠質瘤細胞系SWO-38中克隆出SWOZ1和SWOZ2兩株亞系［4-5］，同時我們利用敏感細胞株SWOZ2誘導出對卡氮芥［carmustine，1，3-bis(2-chloroethyl)-1-nitrosourea，BCNU］耐藥的細胞系SWOZ2-BCNU［6］。SWOZ2-BCNU 細胞對BCNU 耐藥性較SWOZ2細胞高出約5倍，為我們研究人腦膠質瘤獲得性耐藥提供了理想的細胞模型［7］。

真核翻譯起始因子4E結合蛋白1(eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein 1，4EBP1)由118個氨基酸組成，編碼基因定位于染色體8p12，對真核翻譯起始因子4E(eukaryotic translation initiation factor 4E，eIF4E)活性的調節發揮重要的作用。4E-BP1主要參與蛋白質合成、細胞生長、增殖和代謝，近年研究發現其與多種腫瘤的惡性度和預后密切相關［8-10］。2009 年 Tam 等［11］報道了4E-BP1參與調節肝癌細胞對化療藥物的敏感性，最近又有學者相繼報道了磷酸化4E-BP1作為腫瘤細胞對化療藥敏感的標志物［12-13］，但暫無4E-BP1與膠質瘤耐藥的報道。前期研究中我們發現人腦膠質瘤SWOZ2細胞中4E-BP1表達較其獲得性耐藥細胞株SWOZ2-BCNU明顯增加。本文通過RNA干擾實驗探討4EBP1及其磷酸化水平對人腦膠質瘤細胞BCNU耐藥性的影響，為尋找克服膠質瘤獲得性耐藥的新靶點提供理論依據。

材料和方法

1 主要材料和儀器

人腦膠質瘤細胞SWO-38由暨南大學醫學院病理學教研室自建，SWOZ2細胞從SWO-38細胞系中通過單克隆形式分離獲得，耐藥細胞株SWOZ2-BCNU由SWOZ細胞通過BCNU大劑量誘導獲得。改良型RPMI-1640購自HyClone，細胞計數試劑盒-8(cell counting kit-8，CCK-8)購自 WST，4E-BP1、p-4E-BP1(T37/46)、p-4E-BP1(T70)、p-4E-BP1(S65)和α-tubulin抗體均購自CST，核漿分離試劑盒購自BioVision，加強型化學發光液(ECL)購自Pierce，4EBP1 siRNA由銳博公司設計合成，Lipofectamine 2000脂質體購于Invitrogen，垂直電泳槽及半干式電轉移儀器均購自Bio-Rad。

2 方法

2.1 細胞培養 人腦膠質瘤SWOZ2和SWOZ2-BCNU細胞培養于RPMI-1640培養基，其中含10%胎牛血清。將培養瓶置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中培養。

2.2 蛋白提取及Western blotting檢測 收集細胞，按照1×1012cells/L加入預冷的RIPA buffer和苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)混合液。取蛋白樣本10～20 μg，經5%和10% 十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)2 h(濃縮膠60 V，分離膠100 V)，電轉儀350 mA恒流1 h轉印至硝酸纖維素膜，經5%BSA室溫封閉1 h，Ⅰ抗 4E-BP1、p-4E-BP1(T37/46)、p-4E-BP1(T70)、p-4E-BP1(S65)和 α-tubulin(1∶1 000 稀釋)4℃孵育過夜，TBS-T洗膜3次，Ⅱ抗稀釋液(稀釋比例1∶3 000)室溫孵育2 h，ECL底物化學發光試劑盒顯影，X膠片曝光、顯影、定影，BI2000灰度掃描分析條帶。

2.3 siRNA-脂質體混合物的制備及轉染 制備過程嚴格遵守脂質Lipofectamine 2000脂質體說明書要求，優化siRNA和脂質體的用量提高轉染效率。最終選用的siRNA濃度為50 nmol/L，稀釋siRNA和Lipofectamine 2000轉染試劑所選用的培養基均不含血清和抗生素，轉染約6 h后更換含有血清不含抗生素的培養基，根據實驗要求進行后續實驗。

2.4 耐藥性檢測 將呈對數生長的 SWOZ2和SWOZ2-BCNU細胞以每孔1 000個接種于96孔培養板中，培養24 h后換入藥物濃度呈2倍遞增的BCNU(2～128 mg/L)，另設不加藥物的對照孔以及不加藥物和細胞的空白對照，每種藥物濃度做4個平行孔。培養72 h后，更換培養基，加入100 μL不含藥物的新鮮培養基和10 μL CCK-8試劑，繼續培養2 h后在酶標儀上檢測波長為450 nm的吸光度(absorbance，A)，用 SPSS 13.0 軟件中的 Probit法計算出藥物的半數抑制濃度(50%inhibitory concentration，IC50)。

2.5 細胞免疫熒光檢測 SWOZ2和SWOZ2-BCNU細胞接種于已放入蓋玻片的6孔培養板，24 h貼壁后4%多聚甲醛固定30 min，0.2%Triton X-100室溫10～15 min，10%BSA 封閉60 min，加4E-BP1和 p-4E-BP1(T70)Ⅰ抗(1∶200稀釋)4℃靜置過夜，避光下滴加熒光標記的Ⅱ抗，室溫孵育1 h，每孔分別加入適量的DAPI溶液，將蓋玻片蓋于載玻片上，緩沖甘油封片，避光條件下，用激光共聚焦顯微鏡觀察并拍照。

3 統計學處理

采用SPSS 13.0統計軟件分析，數據以均數±標準差(mean±SD)表示，組間均數比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 4E-BP1及其磷酸化蛋白在SWOZ2和SWOZ2-BCNU細胞中的表達

獲得性耐藥細胞株SWOZ2-BCNU中4E-BP1及其磷酸化蛋白 p-4E-BP1(T37/46)、p-4E-BP1(T70)和p-4E-BP1(S65)表達較SWOZ2細胞明顯下降(P＜0.05)，但2株細胞中p-4E-BP1(T70)占總蛋白比例的差異無統計學意義(P＞0.05)，見圖1。這說明4E-BP1通過表達量的改變參與人腦膠質瘤細胞的獲得性耐藥。

2 4E-BP1沉默后SWOZ2細胞對BCNU耐藥性的變化

Figure 1.Expression of 4E-BP1 and its phosphorylated proteins in SWOZ2 and SWOZ2-BCNU cells.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs SWOZ2 group.圖14E-BP1及其磷酸化蛋白在SWOZ2和SWOZ2-BCNU細胞中的表達水平

小分子RNA干擾4E-BP1基因的有效濃度為50 nmol/L，48 h后Western blotting檢測顯示4E-BP1及其磷酸化蛋白表達明顯下降 (P＜0.05)，見圖2A。下調4E-BP1表達后SWOZ2細胞對BCNU的敏感性明顯下降 (P＜0.05)，IC50值明顯增高 (P＜0.05)，出現了藥物抵抗，見圖2B、C。

Figure 2.Down-regulation of 4E-BP1 reduced the sensitivity of SWOZ2 cells to BCNU.A:expression of 4E-BP1 and its phosphorylated proteins in SWOZ2 cells with or without 4E-BP1 siRNA transfection was detected by Western blotting;B:viability of SWOZ2 cells with or without 4E-BP1 siRNA transfection treated with different concentrations of BCNU was measured by CCK-8 assay;C:IC50of BCNU for SWOZ2 cells with or without 4E-BP1 siRNA transfection.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control group.圖2 小干擾RNA下調4E-BP1表達后SWOZ2細胞對BCNU耐藥性的改變

3 4E-BP1及其磷酸化蛋白 p-4E-BP1(T70)在SWOZ2和SWOZ2-BCNU細胞中表達位置的差異

激光共聚焦顯微鏡檢測4E-BP1及p-4E-BP1(T70)在SWOZ2和SWOZ2-BCNU細胞中的表達位置發現，總4E-BP1在2株細胞細胞核及細胞漿中呈均勻分布，見圖3A。磷酸化4E-BP1(T70)蛋白在SWOZ2細胞核、漿中也呈相對均勻分布，但在SWOZ2-BCNU細胞核中表達較細胞漿中明顯增強，見圖3B，說明p-4E-BP1(T70)蛋白在BCNU誘導耐藥的過程中逐漸出現了核轉位。使用核漿分離試劑盒分別檢測2株細胞核、漿中4E-BP1和p-4E-BP1(T70)蛋白含量，顯示SWOZ2-BCNU細胞核中 p-4E-BP1(T70)蛋白比細胞漿中明顯增多(P＜0.05)，見圖3C，與激光共聚焦顯微鏡檢測結果相符。這說明在藥物誘導的耐藥過程中4E-BP1不但出現了表達量的減少，其磷酸化蛋白還出現了核轉位。

Figure 3.Subcellular localization of 4E-BP1 and p-4E-BP1(T70)in SWOZ2 and SWOZ2-BCNU cells.A:localization of 4E-BP1 in SWOZ2 and SWOZ2-BCNU cells detected by laser confocal microscopy;B:localization of p-4E-BP1(T70)in SWOZ2 and SWOZ2-BCNU cells detected by laser confocal microscopy;C:expression of 4EBP1 and p-4E-BP1(T70)proteins in the cytosol and nucleus of SWOZ2 and SWOZ2-BCNU cells detected by Western blotting.Mean± SD.n=3.*P ＜0.05 vs SWOZ2 group.圖34E-BP1及p-4E-BP1(T70)在SWOZ2和SWOZ2-BCNU細胞中表達位置的差異

討 論

目前腦膠質瘤主要以外科手術治療為主，由于腦膠質瘤呈浸潤性生長且多處于腦部重要結構，手術常無法徹底切除，因此化療成為腦膠質瘤治療中必不可少的輔助治療方法。既往研究表明，腫瘤耐藥性的產生是基于多因素參與的復雜調控網絡系統。探究腦膠質瘤耐藥的分子調控機制，尋找有效的逆轉耐藥的靶點，是改善腦膠質瘤患者生存率的關鍵。

4E-BP1主要通過自身不同的磷酸化狀態來調節eIF4E的活性。在大多數細胞中p-4E-BP1(T70)在核漿中均有表達。但最近有研究發現，p-4E-BP1(T70)在子宮內膜腺癌及HeLa細胞核中表達較細胞質中明顯增加［14-15］。在本研究中SWOZ2細胞p-4EBP1(T70)蛋白在細胞核漿是相對均勻分布的，但在獲得性耐藥細胞株中p-4E-BP1(T70)蛋白在細胞核中的表達較細胞質中明顯增加，說明磷酸化4E-BP1在獲得性耐藥過程中出現了向核內轉移的現象。雖然我們對p-4E-BP1(T70)蛋白產生核轉位的機制仍不清楚，但這種蛋白質定位的差異也間接暗示4EBP1參與了膠質瘤獲得性耐藥的產生。

4E-BP1不但參與蛋白質合成、細胞生長、增殖和代謝，最新的研究還發現其參與維持紡錘體和基因的穩定性，具有調控線粒體呼吸功能等多重生物學活性［16-17］。也有研究報道4E-BP1表達水平與腫瘤的惡性度相關［18］。本研究結果顯示小干擾RNA下調SWOZ2細胞4E-BP1的表達后，細胞出現明顯的藥物抗性，模擬了獲得性耐藥細胞的改變。這說明獲得性耐藥細胞中4E-BP1表達下調不是一個邊緣現象，4EBP1可能是腦膠質瘤獲得耐藥的關鍵蛋白，改變4EBP1的表達水平可以改變膠質瘤的耐藥性。

為驗證體外實驗，課題組在臨床中尋找既有原發腫瘤標本又有復發后組織標本的病例，發現復發后腫瘤組織中4E-BP1表達有明顯減少趨勢。但由于惡性腦膠質瘤生存期短，復發的組織標本數有限，這部分數據有待增大樣本量后再整理發表。

綜上所述，4E-BP1在人腦膠質瘤獲得性耐藥細胞株中表達減少，通過小干擾RNA下調4E-BP1的表達能重復此現象，并且磷酸化4E-BP1在獲得性耐藥過程中出現了明顯的細胞定位改變，說明4E-BP1參與了人腦膠質瘤獲得性耐藥，其耐藥的具體機制值得我們進一步研究。

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