shRNA介導(dǎo)的hWAPL表達(dá)沉默對人宮頸癌CaSki細(xì)胞增殖與凋亡的影響*

潘巍巍， 徐 營， 曹利仙， 沈忠飛， 郭連軍， 宋方洲△

宮頸癌是婦科最常見的惡性腫瘤，發(fā)病率逐年升高，并且呈現(xiàn)年輕化的趨勢。因此，研究預(yù)防治療宮頸癌的方法已成為人們關(guān)注和研究的熱點［1-2］。近年發(fā)現(xiàn)，人半翼(human wings apart-like，hWAPL)基因與宮頸癌及HPV關(guān)系密切［3］，是果蠅體內(nèi)半翼(wings apart-like，WAPL)基因在人體內(nèi)的同源序列。WAPL基因是1977年在果蠅體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一個基因［4-5］，定位于果蠅的X染色體 2D4～2D5。在有絲分裂中，WAPL基因編碼的蛋白質(zhì)主要功能是控制染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，維持染色單體的黏合［6-7］。hWAPL長約30 793 bp，定位于10q23.2，其編碼一種聚合錨定蛋白，可以在有絲分裂前期使染色體臂的聚合適時解離［8-9］。研究證實hWAPL基因是一種宮頸癌特異性高表達(dá)基因［10-12］，其蛋白在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中起極其重要的作用。為進(jìn)一步探討hWAPL在細(xì)胞增殖和凋亡中的作用及其作為分子靶點用于腫瘤治療的潛在價值，本研究采用RNA干擾技術(shù)抑制hWAPL的表達(dá)，在體內(nèi)和體外分別觀察了其對人宮頸癌CaSki細(xì)胞增殖與凋亡的影響。

材料和方法

1 材料

1.1 主要試劑 質(zhì)粒載體pGenesil(武漢晶賽生物公司);Hind III、EcoR I、BamH I、Sal I和 T4 DNA 連接酶(大連寶生物公司);Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen);λDNA/Hind III DNA marker、DL2000 DNA marker、質(zhì)粒提取試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒、DNA小量膠回收純化試劑盒和卡那霉素均為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品;G418(Amresco);胎牛血清(HyClone);DMEM/FI2細(xì)胞培養(yǎng)基(Invitrogen)，青鏈霉素(Gibco)，Hoechst 33258染色液和退火緩沖液購于碧云天生物技術(shù)研究所，DH5α由本實驗室保存，β-actin和cleaved caspase-3抗體購于Cell Signaling，hWAPL、p21 和 p27 抗體購自 Santa Cruz，免疫組化Ⅱ抗購自Molecular Probes，Ⅲ抗ABC kit和DAB顯色液購自Vector Laboratories，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于Bio-Rad，Annexin V-PE試劑盒購自BD。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) CaSki細(xì)胞(重慶醫(yī)科大學(xué)提供)以含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。0.25%EDTA胰酶消化細(xì)胞，2～3 d傳代1次，取對數(shù)生長期細(xì)胞實驗。

1.3 裸鼠 6～8周齡BALB/c裸鼠購自上海斯萊克。裸鼠飼養(yǎng)在重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，SPF級。

2 方法

2.1 pGenesil-1-hWAPL-shRNA穩(wěn)定表達(dá)的CaSki細(xì)胞系的篩選 hWAPL基因的shRNA序列設(shè)計及連接參照文獻(xiàn)［13］。CaSki細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM/F12培養(yǎng)基，含10%胎牛血清，37℃、5%CO2孵箱中過夜，待細(xì)胞匯合度約80%～90%時給細(xì)胞換成無血清培養(yǎng)液，使用Lipofectamine 2000將構(gòu)建好的pGenesil空載體和pGenesil-hWAPL-shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到CaSki細(xì)胞。轉(zhuǎn)染8 h后給細(xì)胞換成正常培養(yǎng)液。24 h后給細(xì)胞加入G418(200 mg/L)篩選10～14 d，獲得穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系。

2.2 實時熒光定量PCR pGenesil空載體和pGenesil-hWAPL-shRNA轉(zhuǎn)染CaSki細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，Trizol提取細(xì)胞總RNA.將提取的總RNA(5 μg)按照說明逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA。hWAPL上游引物5’-CCTTAGCCGTGACAGAAC-3’，下游引物 5’-GGAATCGGCACTGTCTTG-3’，產(chǎn)物片段為246 bp;β-actin上游引物 5’-GCTCTTTTCCAGCCTTCCTT-3’，下游引物5’-GTACTTGCGCTCAGGAGGAG-3’，產(chǎn)物片段為279 bp。定量PCR步驟:95℃變性5 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，72 ℃ 32 s，30 個循環(huán)，72 ℃延伸 10 min。數(shù)據(jù)使用Q-RT_Analysis分析軟件處理，使用Graph-Pad Prism 5軟件作圖。

2.3 MTT檢測細(xì)胞增殖 將3×103個穩(wěn)定表達(dá)空載體和pGenesil-hWAPL-shRNA的CaSki細(xì)胞接種于96孔板中，同時設(shè)空白對照。細(xì)胞培養(yǎng)72 h后加入20 μL MTT(5 g/L)，4 ～ 6 h 后加 DMSO(150 μL/well)，振蕩10 s，490 nm檢測。每組設(shè)3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

2.4 Annexin V-PE染色檢測細(xì)胞凋亡 收集細(xì)胞106，預(yù)冷1×PBS洗滌2次，1× binding buffer重懸細(xì)胞，取105個細(xì)胞放置到5 mL離心管中，分別加入5 μL Annexin V-PE 和 5 μL 7-氨基放線菌素(7-aminoactinomycin，7-AAD)混懸細(xì)胞，混勻、室溫避光放置15 min，加400 μL 1 ×binding buffer應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡。

2.5 Hoechst 33258熒光染色檢測細(xì)胞凋亡 將CaSki細(xì)胞接種于24孔板過夜(細(xì)胞爬片生長)，分別向 CaSki細(xì)胞轉(zhuǎn)染 pGenesil-hWAPL-shRNA和pGenesil-shCON，24 h后PBS洗細(xì)胞3次，加入1 mL Hoechst 33258染色液，室溫放置5 min，吸除Hoechst 33258染色液，用PBS洗3次，每次5 min。封片后熒光顯微鏡下觀察。

2.6 裸鼠荷瘤模型 6～8周齡的雌性裸鼠5只SPF級飼養(yǎng)，無菌的條件下給每只裸鼠的兩側(cè)背部皮下分別注射1×106個作為對照的(shCON)CaSki細(xì)胞(左側(cè)背部皮下)和穩(wěn)定表達(dá)hWAPL-shRNA的CaSki細(xì)胞(右側(cè)背部皮下)，待30 d后裸鼠成瘤，取出腫瘤組織中性甲醛固定，脫水，石蠟包埋，切片(5 μm)，行HE染色。

2.7 免疫組化 石蠟切片經(jīng)二甲苯、乙醇脫蠟3次，每次 3 min，水化，3%H2O2避光10 min，0.02 mol/L枸櫞酸鈉抗原修復(fù)，95℃ 15 min，10%山羊血清封閉30 min，Ⅰ抗(1∶200)室溫1 h，1×PBST洗3遍，每次3 min，Ⅱ抗室溫30 min，1×PBST洗3次，每次3 min，Ⅲ抗室溫30 min，1×PBST洗3次，每次3 min。DAB顯色，終止，逐級脫水，中性樹脂封片。

2.8 蛋白質(zhì)印跡分析 吸去培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，1×PBS將細(xì)胞洗滌2次，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，取100 μg總蛋白做 SDS-PAGE，轉(zhuǎn)至 PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉過夜，1×TBST洗3次，每次8 min，分 別 與 內(nèi)參 照 β-actin、cleaved caspase-3、hWAPL、p21和p27抗體(均1∶1 000)4℃孵育過夜，1×PBST洗膜3次，每次8 min。Ⅱ抗孵育，洗膜3次，每次8 min，雜交反應(yīng)后應(yīng)用ECL Western blotting化學(xué)發(fā)光試劑盒暗房顯影。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組間比較采用t檢驗分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 hWAPL-shRNA在CaSki細(xì)胞中干擾效率的檢測

pGenesil載體帶有EGFP，熒光顯微鏡下可看見綠色熒光蛋白表達(dá)。G418篩選轉(zhuǎn)染pGenesil-hWAPL-shRNA和pGenesil-shCON的CaSki細(xì)胞10～14 d后獲得穩(wěn)定表達(dá)shCON和hWAPL-shRNA的細(xì)胞系，熒光顯微鏡下可見強(qiáng)的綠色熒光表達(dá)，見圖1A。實時熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)hWAPL mRNA表達(dá)量明顯減少，與對照相比只有10%左右，見圖1B。Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)干擾后hWAPL蛋白表達(dá)也明顯減少，見圖1C。

2 hWAPL基因沉默抑制CaSki細(xì)胞生長

RNA干擾hWAPL 72 h后，顯微鏡下觀察可見RNA干擾組CaSki細(xì)胞的數(shù)目與對照組相比明顯減少，見圖2A。MTT結(jié)果同樣顯示hWAPL基因沉默組細(xì)胞增殖與對照組相比明顯減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)，見圖2B。

Figure 1.Interference efficiency of hWAPL-shRNA in CaSki cells.A:EGFP expression observed by fluorescence microscopy(×200).B:hWAPL mRNA expression detected by real-time fluorescence quantitative PCR;C:hWAPL protein expression detected by Western blotting.Mean±SD.n=3.＊＊P ＜0.01 vs shCON.圖1 CaSki細(xì)胞中hWAPL shRNA干擾效率的檢測

Figure 2.hWAPL silencing inhibited CaSki cell proliferation.A:numbers of the cells cultured in 6-well plates for 72 h were observed under contrast-phase microscope(×200).B:MTT assay results.Mean±SD.n=3.*P ＜0.05 vs shCON.圖2 hWAPL沉默抑制CaSki細(xì)胞增殖

3 沉默hWAPL基因增加CaSki細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示，對照組細(xì)胞凋亡率為1.4%，RNA干擾hWAPL后CaSki細(xì)胞凋亡率明顯增加到17.8%，見圖3A，這表明 hWAPL沉默增加了CaSki細(xì)胞凋亡。Hoechst 33258染色表明對照組(shCON)細(xì)胞發(fā)生染色質(zhì)凝集、邊緣化的細(xì)胞數(shù)目明顯少于干擾組(hWAPL-shRNA)，干擾組部分細(xì)胞細(xì)胞核出現(xiàn)染色質(zhì)高度凝集、邊緣化、核固縮等凋亡的特征，熒光顯微鏡下可見細(xì)胞核呈現(xiàn)強(qiáng)烈的藍(lán)色熒光，見圖3B。上述結(jié)果表明hWAPL沉默促進(jìn)CaS-ki細(xì)胞發(fā)生凋亡。

4 沉默hWAPL基因降低CaSki細(xì)胞的成瘤能力

為了在體內(nèi)進(jìn)一步驗證hWAPL基因的作用，我們分別給裸鼠背部皮下注射含有shCON和hWAPL-shRNA的CaSki細(xì)胞，30 d后待裸鼠成瘤取出腫瘤組織稱重，對照組的腫瘤明顯大于RNA干擾組，見圖4A。腫瘤組織HE染色顯微鏡觀察可見增殖旺盛的腫瘤細(xì)胞，見圖4C。免疫組化檢測RNA干擾組腫瘤組織中hWAPL表達(dá)明顯減少，而對照組hWAPL表達(dá)較高，見圖4C。RNA干擾組腫瘤組織中增殖細(xì)胞核抗原(proliferative cell nuclear antigaen，PCNA)明顯少于對照組，這表明在裸鼠體內(nèi)hWAPL沉默腫瘤細(xì)胞增殖減弱，見圖4C。該實驗在動物體內(nèi)進(jìn)一步驗證了hWAPL沉默明顯降低CaSki細(xì)胞的成瘤能力。

Figure 3.hWAPL silencing promoted CaSki cell apoptosis.A:flow cytometry results;B:Hoechst 33258 staining results(×400).Mean±SD.n=3.＊＊P ＜0.01 vs shCON.圖3 hWAPL沉默促進(jìn)CaSki細(xì)胞凋亡

5 蛋白質(zhì)印跡分析凋亡相關(guān)蛋白

hWAPL RNA干擾組細(xì)胞中，cleaved caspase-3和細(xì)胞周期相關(guān)蛋白p21、p27的表達(dá)均上調(diào)，見圖5。這表明hWAPL沉默誘發(fā)的細(xì)胞凋亡與細(xì)胞周期抑制蛋白的高表達(dá)有關(guān)。

討 論

細(xì)胞凋亡是由多種基因控制的自主性的程序化死亡過程［13］。凋亡在機(jī)體的生長發(fā)育、細(xì)胞分化、病理狀態(tài)和細(xì)胞清除等方面具有十分重要的意義。而腫瘤細(xì)胞的發(fā)生多存在不同程度的細(xì)胞凋亡過程的異常，是細(xì)胞增殖和凋亡調(diào)控異常導(dǎo)致平衡失調(diào)的綜合性結(jié)果，因此深入研究腫瘤的凋亡過程對腫瘤的治療有著重要的意義。

Figure 4.Tumorigenic capacity of CaSki cells with hWAPL silencing in nude mice.CaSki cells transfected with shCON and hWAPL-shRNA(1×106cells for each)were subcutaneously implanted into the left and right flanks of nude mice，respectively.After 30 days，the tumors were removed.A:tumor size measurement;B:tumor weighing results;C:HE staining of tumor tissues and immunohistochemical staining for hWAPL and PCNA expression in tumor tissues(×200).Mean±SD.n=6.＊＊P ＜0.01 vs shCON.圖4 在裸鼠體內(nèi)hWAPL影響細(xì)胞增殖

Figure 5.Western blotting analysis of the protein expression of cleaved caspase-3，p27 and p21 in CaSki cells.Mean±SD.n=3.＊＊P ＜0.01 vs shCON.圖5 Western blotting檢測凋亡及細(xì)胞周期抑制相關(guān)蛋白

本實驗采用RNA干擾技術(shù)，研究hWAPL基因沉默后對人宮頸癌CaSki細(xì)胞增殖和凋亡的影響。在前期研究中我們成功構(gòu)建針對hWAPL基因的shRNA真核表達(dá)載體。經(jīng)酶切和測序鑒定表明成功構(gòu)建了 3 個 pGenesil-hWAPL-shRNA［14-15］，采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染CaSki細(xì)胞后，在倒置熒光顯微鏡下觀察到大量綠色熒光蛋白表達(dá)，表明裝載到質(zhì)粒上的基因片段通過脂質(zhì)體的介導(dǎo)成功轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)并高表達(dá)EGFP，實時定量PCR和Western blotting檢測結(jié)果表明，構(gòu)建的pGenesil-hWAPL-shRNA能夠有效抑制內(nèi)源hWAPL表達(dá)。我們通過Annexin V-PE和Hoechst 33258染色方法檢測發(fā)現(xiàn)shRNA介導(dǎo)的hWAPL表達(dá)沉默促進(jìn)了CaSki細(xì)胞的凋亡，Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)cleaved caspase-3表達(dá)明顯增加。Caspase-3是半胱氨酸蛋白酶家族中導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的最強(qiáng)大的最終效應(yīng)因子，受多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控，caspase-3被激活后，作用于細(xì)胞質(zhì)成分，而使細(xì)胞發(fā)生凋亡［16］。

p27基因是一種調(diào)控細(xì)胞周期并抑制細(xì)胞分裂的重要基因，其蛋白可直接抑制cyclin-CDK復(fù)合物的生物學(xué)活性，使細(xì)胞停滯于G期，同時具有促進(jìn)細(xì)胞分化、介導(dǎo)細(xì)胞間黏附及誘導(dǎo)凋亡等功能，其蛋白表達(dá)異常導(dǎo)致細(xì)胞增殖與凋亡失衡，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展［17］。p21蛋白可以與cyclin和CDK結(jié)合，從而抑制cyclin-CDK復(fù)合物的激酶活性，抑制Rb蛋白磷酸化，使細(xì)胞停滯于G期，不能進(jìn)入S期，起到細(xì)胞周期調(diào)控作用［18］。hWAPL基因沉默增加了細(xì)胞周期抑制蛋白p21和p27的表達(dá)，從而抑制CaSki細(xì)胞增殖導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加。因此，以hWAPL為靶點的治療很可能同時具有抑制細(xì)胞增殖、誘發(fā)細(xì)胞凋亡和提高化療藥物敏感性的多重效應(yīng)。

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