桂皮酸聯(lián)合順鉑對人肝癌MHCC97細(xì)胞的增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用

邵軍良， 韓明芳， 黎運(yùn)呈△

我國是肝癌高發(fā)國家，全世界50%以上的新發(fā)和死亡肝癌患者發(fā)生在中國。目前以手術(shù)、化療和放療為主的綜合治療的療效不能令人滿意，全世界總體5年生存率最高的國家只有10%左右，故尋找治療肝癌的其它治療方法就成為人們研究的焦點［1］。近年來，中西醫(yī)結(jié)合治療肝癌的研究成為當(dāng)前的熱點和前沿，其在改善臨床癥狀、提高生存質(zhì)量、順利完成化療、延長生存期等方面有一定的優(yōu)勢。

桂皮酸(cinnamic acid，CA)是傳統(tǒng)中藥肉桂中的一種重要成分，其抗腫瘤作用首次見于1995年Liu等［2］的報道，桂皮酸在體外能抑制肺癌、前列腺癌、惡性膠質(zhì)瘤、黑色瘤細(xì)胞等癌細(xì)胞的增殖，且對黑色瘤細(xì)胞有促進(jìn)分化的作用。綜合近幾年的國內(nèi)外研究亦表明［3-8］，桂皮酸具有廣泛的抗實體瘤活性，包括黑色素瘤、激素難治性前列腺癌、肺癌、膠質(zhì)細(xì)胞瘤、肝癌、白血病等，它對腫瘤細(xì)胞具有抑制其生長增殖、誘導(dǎo)其分化和凋亡的作用。本實驗通過桂皮酸聯(lián)合順鉑(cisplatin)對人肝癌MHCC97細(xì)胞的增殖抑制及凋亡誘導(dǎo)作用進(jìn)行研究，為臨床聯(lián)合桂皮酸治療肝癌提供可靠的實驗依據(jù)。

材料和方法

1 材料

1.1 桂皮酸 購自Alfa Aesar化學(xué)產(chǎn)品有限公司。使用時用0.1%二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)溶解于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基后，用0.45 μm一次性濾器過濾后配成不同濃度。

1.2 化學(xué)藥品和試劑 Cisplatin(齊魯制藥有限公司，批號為100703);RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco，批號為1120708);胎牛血清(Gibco，批號為980412);Annexin V-FITC/PI試劑盒(BD，批號為18354);MTT(碧云天生物技術(shù)有限公司，批號為080721);兔抗人caspase-3Ⅰ抗(Cell Signaling，批號為 Lot 13)，其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞MHCC97和正常人肝細(xì)胞L-02由上海中科院提供。所有細(xì)胞在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其中含青霉素(1×105U/L)和鏈霉素(100 mg/L)，培養(yǎng)條件是37 ℃、5%CO2。

2.2 細(xì)胞增殖曲線及IC50值檢測 MTT比色法檢測CA單獨或聯(lián)合cisplatin作用24 h和48 h時對細(xì)胞增殖的抑制作用。對數(shù)生長期的細(xì)胞(5×103cells/well)種植到96孔板上過夜，CA(2 400、1 200、600、300、150、75 和 37.5 mg/L)、cisplatin(64、32、16、8、4、2 和 1 mg/L)和 CA+cisplatin 聯(lián)合組分別作用肝癌和正常肝細(xì)胞24 h、48 h。加入20 μL MTT，4 h 孵育后，棄 MTT，并加入 150 μL DMSO 在37℃作用10 min直到結(jié)晶被溶解。用酶標(biāo)儀(Bio-Rad 680)在波長490 nm時檢測A值。按下列公式計算，抑制率(%)=(A正常組－ A藥物組)/(A正常組－A空白組)×100%。細(xì)胞被抑制50%時的濃度為IC50，計算CA和cisplatin單用時的IC50值。

2.3 凋亡的形態(tài)學(xué)檢測 取CA和cisplatin單用時的IC50值作為聯(lián)合用藥濃度。對數(shù)生長期的細(xì)胞(1×108/well)種植于6孔培養(yǎng)板24 h孵育后，CA和cisplatin單獨或聯(lián)合作用MHCC97細(xì)胞共48 h。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變。

2.4 凋亡細(xì)胞的定量分析 凋亡細(xì)胞采用annexin V和PI雙染的方法檢測。CA和cisplatin單獨或聯(lián)合作用MHCC97細(xì)胞共48 h時被檢測。細(xì)胞(1×108/L)被種植到6孔板并孵育48 h，收集懸浮的和貼壁的細(xì)胞。1 500 r/min離心5 min，4℃條件下細(xì)胞樣品被冰冷的PBS洗2次。棄上清，(5×108～5×109/L)細(xì)胞被重懸在冰冷的稀釋了的結(jié)合液中。取 annexin V-FITC 溶液(5 μL)和 PI(2.5 μL)加到100 μL細(xì)胞懸液中，小心混勻并避光在冰上孵育10 min。加冰冷的結(jié)合液400 μL到細(xì)胞懸液中混勻后上機(jī)檢測，并采用CellQuest流式軟件分析。

2.5 Western blotting檢測凋亡蛋白caspase-3的活化 CA和cisplatin單獨或聯(lián)合作用于MHCC97細(xì)胞(2×105cells/well)24 h和48 h。收集細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗滌2次，分別加入適量含PMSF的RAPI裂解液，冰上裂解30 min，4℃下12 000 r/min離心15 min，取上清用BCA法測定蛋白濃度。取總蛋白上清液24 μL，加6 μL 5×上樣緩沖液混勻。用 PCR 儀煮沸10 min，變性后取20 μg上樣，進(jìn)行 SDS-PAGE電泳分離蛋白(12%分離膠，5%濃縮膠)，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上(300 mA，30 min)，5%脫脂牛奶封閉非特異抗原2 h，按照蛋白質(zhì)marker切割PVDF膜，并分別加入 caspase-3(1∶500)或者 β-actin(1∶500)過夜，PBS-T洗滌3次，每次 10 min。再分別加入1∶5 000稀釋的羊抗兔 IgG-HRP，室溫振搖1 h，PBST洗滌3次，每次15 min。ECL系統(tǒng)顯色，凝膠成像儀檢測，采用Quantity One分析軟件進(jìn)行條帶灰度值分析。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。實驗重復(fù)5次。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。用單因素方差分析、直線相關(guān)與回歸等方法進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 CA的細(xì)胞生長抑制效率

MHCC97和L-02細(xì)胞經(jīng)24 h無血清培養(yǎng)后，用不同濃度 CA(2 400、1 200、600、300、150、75 和37.5 mg/L)作用24 h和48 h后檢測增殖抑制效應(yīng)，見圖1A。MHCC97細(xì)胞的生長以濃度及時間依賴的方式被抑制，CA作用于 MHCC97細(xì)胞的 IC50值是248.52 mg/L(24 h)和178.65 mg/L(48 h)。值得注意的是，CA對肝癌細(xì)胞MHCC97有增殖抑制作用的濃度和時間時卻對L-02無明顯影響。因此，CA在相同濃度及作用時間的條件下具有腫瘤選擇性。

2 Cisplatin的細(xì)胞生長抑制效應(yīng)

圖1B顯示不同濃度cisplatin作用MHCC97和L-02細(xì)胞24 h和48 h可以明顯有效抑制細(xì)胞增殖。當(dāng)cisplatin作用相同濃度時，細(xì)胞生長抑制率隨著時間逐漸增加;當(dāng)cisplatin作用相同時間時，細(xì)胞生長抑制率隨著濃度增加而增加。結(jié)果表明，cisplatin作用肝癌細(xì)胞MHCC97的生長抑制率均呈濃度及時間依賴性。Cisplatin作用 MHCC97細(xì)胞的 IC50值是16.49 mg/L(24 h)和13.00 mg/L(48 h)。此外，cisplatin對正常細(xì)胞的抑制作用明顯。

3 CA聯(lián)合cisplatin作用細(xì)胞的生長抑制率

不同濃度的CA聯(lián)合不同濃度cisplatin作用于MHCC97細(xì)胞時，當(dāng)兩藥以濃度固定比 37.5∶1(CA∶cisplatin)作用于肝癌細(xì)胞MHCC97和正常肝細(xì)胞L-02共24 h和48 h時，CA+cisplatin聯(lián)合作用對MHCC97細(xì)胞的IC50值分別是(88.75±2.37)mg/L(24 h)和(46.32±1.24)mg/L(48 h)。圖1C表明CA和cisplatin在低濃度聯(lián)合作用MHCC97細(xì)胞時具有很好的增殖抑制作用，聯(lián)用時可降低藥物作用濃度。此外，聯(lián)用組在相同作用濃度和時間時卻對正常肝細(xì)胞L-02無明顯影響，表明CA和cisplatin聯(lián)合作用可增大CA的作用且減少cisplatin的毒性。

Figure 1.Curves of growth inhibitory rates of MHCC97 and L-02 cells after treated with CA，cisplatin and CA+cisplatin.Mean±SD.n=5.圖1 CA、cisplatin和CA+cisplatin作用于MHCC97和L-02細(xì)胞24 h和48 h后的生長抑制率曲線

4 CA和cisplatin單用或聯(lián)合作用時MHCC97細(xì)胞的凋亡形態(tài)學(xué)改變

如圖2顯示，當(dāng)藥物作用后細(xì)胞生長被抑制，可觀察到顯著的形態(tài)學(xué)改變?nèi)缂?xì)胞分散，體積減少，核漿比例減少，細(xì)胞膜起泡，出現(xiàn)凋亡小體等。當(dāng)細(xì)胞膜完整時，細(xì)胞邊界皺縮且濃染。包漿產(chǎn)生透明空泡，細(xì)胞質(zhì)產(chǎn)生放射狀、釘狀和葉狀的突起。繼續(xù)發(fā)展則細(xì)胞膜出泡和凋亡小體形成。與CA+cisplatin組比較，cisplatin組壞死細(xì)胞較多。當(dāng)兩藥聯(lián)合時凋亡更加明顯，細(xì)胞體積減少，細(xì)胞間隙加寬，邊界更清楚，凋亡形態(tài)更明顯且較少壞死細(xì)胞。

Figure 2.Morphological changes of MHCC97 cells under inverted light microscope after treated with CA and cisplatin either in combination or alone for 48 h(×400).圖2 CA和cisplatin單用或聯(lián)合作用MHCC97細(xì)胞48 h細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變

5 CA和cisplatin單用或聯(lián)合作用的凋亡誘導(dǎo)作用

與正常對照組比較，CA或cisplatin單用和聯(lián)合作用MHCC97細(xì)胞時，早期及總的凋亡率增加，聯(lián)合組的凋亡誘導(dǎo)作用強(qiáng)于CA或cisplatin單用組。此外，cisplatin組中晚期凋亡或壞死細(xì)胞比CA或聯(lián)用組高，而早期凋亡細(xì)胞剛好相反，見圖3和表1。

Figure 3.The individual or combined effects of CA and cisplatin on apoptotic rate of MHCC97 cells detected by annexin V-FITC/PI double-staining.Mechanically injured cells are in the left upper quadrant(a zone，annexin V－/PI+);mid-and late apoptotic cells or necrotic cells are in the right upper quadrant(b zone，Annexin V+/PI+);early apoptotic cells are in the right lower quadrant(c zone，annexin V+/Pl－);normal cells are in the left lower quadrant(d zone，annexin V－/PI－).b+c:total apoptotic cells.圖3 Annexin V-FITC/PI雙染檢測CA和cisplatin單用或聯(lián)用對MHCC97細(xì)胞凋亡的影響

表1 流式細(xì)胞術(shù)檢測CA和cisplatin單用或聯(lián)用對MHCC97細(xì)胞凋亡的影響Table 1.The effects of CA or cisplatin alone or in combination on apoptotic rate of MHCC97 cells detected by annexin V-FITC/PI double-staining(%.Mean±SD.n=5)

6 Western blotting檢測caspase-3蛋白的活化

如圖4顯示，CA和cisplatin單用或聯(lián)用24 h和48 h時，cleaved caspase-3/β-actin的比值隨著作用時間的增加而逐漸增大，表明caspase-3隨著時間的延長被水解活化了。圖4B顯示CA單用時cleaved caspase-3/β-actin的比值均明顯高于cisplatin組。在相同濃度CA或cisplatin單用或聯(lián)用時cleaved caspase-3/β-actin的比值均具有時間依賴關(guān)系。此外，CA和cisplatin聯(lián)用比各自單用時活化程度更高。

討 論

肝癌是嚴(yán)重危害人民群眾健康的疾病之一，目前尚缺乏理想的治療藥物。放化療對肝癌雖有一定效果，但副作用較多，部分病人難以接受。目前，中草藥治療癌癥日益受到人們的關(guān)注。桂皮酸是從肉桂樹皮等植物中分離的單體化合物，是苯丙氨酸在植物組織內(nèi)的脫氨基產(chǎn)物，是調(diào)節(jié)植物細(xì)胞生長和分化的激素樣物質(zhì)。國內(nèi)外研究表明，桂皮酸具有廣泛的抗實體瘤活性。細(xì)胞凋亡是機(jī)體生長發(fā)育、細(xì)胞分化和病理狀態(tài)下細(xì)胞的程序性死亡過程，參與機(jī)體清除衰老或異常細(xì)胞的機(jī)制，與多種疾病如自身性免疫疾病、癌癥等有關(guān)。因此很多癌癥治療都是通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡來實現(xiàn)的［9］。本研究初步探討了桂皮酸聯(lián)合順鉑對人肝癌細(xì)胞株MHCC97的增殖抑制及凋亡誘導(dǎo)作用，為臨床治療腫瘤提供新途徑。

Figure 4.The expression of cleaved caspase-3 protein in MHCC97 cells detected by Western blotting after exposure to CA and cisplatin either alone or in combination for 24 or 48 h.1:control group;2:cisplatin group;3:CA group;4:CA+cisplatin group.Mean ± SD.n=5.＊＊P ＜ 0.01 vs 1;#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01 vs 2;△△P ＜0.01 vs 3;▲▲P ＜0.01 vs 24 h.圖4 Western blotting法檢測CA和cisplatin單獨或聯(lián)合作用于MHCC97細(xì)胞24和48 h caspase-3活化蛋白表達(dá)的水平

本實驗首先觀察了桂皮酸對MHCC97細(xì)胞的增殖抑制作用。結(jié)果表明，不同濃度桂皮酸和順鉑作用于MHCC97細(xì)胞后，抑制率與藥物濃度存在劑量和時間依賴關(guān)系。然而，不同濃度桂皮酸在相同作用濃度和時間時卻對正常肝細(xì)胞L-02無明顯影響，當(dāng)桂皮酸和順鉑聯(lián)用時，IC50值均較單用時減小，表明聯(lián)合應(yīng)用時可增大桂皮酸和順鉑的抑制肝癌細(xì)胞增殖作用且減小化療藥物的毒性。其次，通過應(yīng)用annexin-V/PI細(xì)胞凋亡檢測法檢測桂皮酸對MHCC97細(xì)胞凋亡的影響，證實桂皮酸和順鉑單獨或聯(lián)合應(yīng)用時均可誘導(dǎo)MHCC97細(xì)胞凋亡。倒置顯微鏡下發(fā)現(xiàn)順鉑單用時可能由于細(xì)胞毒性作用，壞死細(xì)胞較多。當(dāng)桂皮酸和順鉑聯(lián)合作用時凋亡更加明顯，細(xì)胞體積減少，細(xì)胞間隙加寬，邊界更清楚，凋亡形態(tài)更明顯且較少壞死細(xì)胞。細(xì)胞的凋亡一般分為caspase-3依賴和非依賴途徑，我們還發(fā)現(xiàn)桂皮酸和順鉑主要通過caspase-3依賴途徑誘導(dǎo)MHCC97細(xì)胞凋亡，并且桂皮酸和順鉑單獨或聯(lián)合作用24 h、48 h時，caspase-3活化片段的蛋白表達(dá)量隨著時間的增加而加強(qiáng)。桂皮酸單獨或聯(lián)合順鉑作用肝癌細(xì)胞時caspase-3的活化比例明顯高于順鉑單用組，可能由于caspase-3活化片段主要檢查早期凋亡，而順鉑主要引起的中晚期凋亡和壞死細(xì)胞較多有關(guān)。這與順鉑流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果非常吻合，更加證明了我們的結(jié)論。

本實驗初步研究表明，桂皮酸有明顯抑制MHCC97細(xì)胞生長的作用，并且該抑制作用可能與激活caspase-3有關(guān)，是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡實現(xiàn)的。

［1］ McGlynn KA，London WT.The global epidemiology of hepatocellular carcinoma:present and future［J］.Clin Liver Dis，2011，15(2):223-243.

［2］ Liu L，Hudgins WR，Shack S，et al.Cinnamic acid:a natural product with potential use in cancer intervention［J］.Int J Cancer，1995，62(3):345-350.

［3］ 朱文淵，劉 昆.桂皮酸和全反式維甲酸及維生素C對HL-60細(xì)胞的分化研究［J］.中華腫瘤防治雜志，2006，13(8):592-595.

［4］ Noda S，Miyazaki T，Tanaka T，et al.Production of Streptoverticillium cinnamoneum transglutaminase and cinnamic acid by recombinant Streptomyces lividans cultured on biomass-derived carbon sources［J］.Bioresour Technol，2012，104:648-651.

［5］ Kong YH，Jo YO，Cho CW，et al.Inhibitory effects of cinnamic acid on melanin biosynthesis in skin［J］.Biol Pharm Bull，2008，31(5):946-948.

［6］ Hussain MI，Reigosa MJ.A chlorophyll fluorescence analysis of photosynthetic efficiency，quantum yield and photon energy dissipation in PSII antennae of Lactuca sativa L.leaves exposed to cinnamic acid［J］.Plant Physiol Biochem，2011，49(11):1290-1298.

［7］ 林德晨，史志周，薛麗燕，等.細(xì)胞周期相關(guān)蛋白cyclin D1、p53和p21WAF1/Cip1在食管鱗癌中的表達(dá)改變及其病理學(xué)意義［J］.遺傳，2010，32(5):455-460.

［8］ 黃越燕，陳曉冬，肖 純，等.流式細(xì)胞術(shù)檢測肉桂酸鍺誘導(dǎo)小鼠U14瘤細(xì)胞凋亡的研究［J］.中國病理生理雜志，2003，19(11):1576.

［9］ Vidya Priyadarsini R，Senthil Murugan R，Maitreyi S，et al.The flavonoid quercetin induces cell cycle arrest and mitochondria-mediated apoptosis in human cervical cancer(HeLa)cells through p53 induction and NF-κB inhibition［J］.Eur J Pharmacol，2010，649(1-3):84-91.