大鼠心肌解剖無復流現象中中性粒細胞的浸潤和GDF-15的動態表達

潘坤穎， 劉千萍， 周 欣， 姜鐵民， 李玉明， 張 梅△

無復流(no-reflow)是指心外膜冠脈閉塞減輕或解除后，缺血心肌組織并未恢復有效再灌注，微循環血流仍不能完全恢復正常的現象。目前，其發生機制尚不完全清楚。研究發現，損傷區大量中性粒細胞聚集在無復流延展中起重要作用［1］。生長分化因子 15(growth differentiation factor 15，GDF-15)是應激反應性因子，在正常心肌組織幾乎不表達，具有抗凋亡、抗肥大、抑制單核巨噬細胞活化等心肌保護作用［2-3］。本實驗通過動物模型模擬臨床急性心肌梗塞后經皮冠狀動脈介入(percutaneous coronary intervention，PCI)再通治療，研究無復流現象中中性粒細胞浸潤情況和GDF-15的動態表達。

材料和方法

1 動物分組及材料

雄性Wistar大鼠144只(中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心提供，體重250～280 g)，隨機分為I/R組和sham組各72只。I/R組采用開胸冠狀動脈左前降支結扎方法，缺血60 min后分別再灌注 2 h、4 h、6 h、12 h、24 h 和 7 d，建立心肌缺血/再灌注損傷模型［4-5］，每個時點12只，其中6只隨機進行染色，其余6只用于分子生物水平檢測。Sham組只穿線不結扎。術后大鼠給予自由飲食，于不同時點取材:檢測心肌組織中GDF-15 mRNA及蛋白表達和髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)活性;取心室心肌進行石蠟包埋切片，HE染色大體評估心肌損傷情況;硫磺素S(thioflavin S，Sigma)、酞菁藍(phthalocyanine blue，鄭州勤實染料公司)和氯化三苯基四氮唑(triphenyltetrazolium chloride，TTC)等。

2 方法

2.1 模型制備 0.4%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔麻醉，氣管插管，接呼吸機、心電圖。采用胸外結扎法，Y形線結扎左冠狀動脈，誘導缺血1 h后，剪斷結扎線，完成再灌注［2］。缺血時，心肌局部變暗，活動減弱，心電圖ST-T呈明顯上抬。再灌注時，心肌局部搏動恢復，心電圖有不同程度的壞死性Q波及ST段回落［3］。

2.2 基因水平檢測 再灌注不同時間取材，迅速分離并取梗死及梗死周邊區心肌組織，行RNA提取，方法按照Trizol試劑盒說明書的操作步驟進行。Real-time PCR法檢測GDF-15 mRNA的表達。引物序列 GDF-15 上游引物 5’-GACCTAGGTTGGAGCGACTG-3’，下 游 引 物 5’-TAAGAACCACCGGGGTGTAG-3’。β-actin 上游引物 5’-TACCACATCCAAGGAAGGCAGCA-3’，下 游 引 物 5’-TGGAATTACCGCGGCTGCTGGCA-3’。實驗重復3次，復孔3個。以公式2－ΔΔCt計算目的基因相對于內參照基因的表達量。

2.3 MPO活性檢測 取梗死及梗死周邊區心肌組織置于勻漿器內，剪碎，制備勻漿，然后以3 000 r/min的速度離心15 min，取上清液置管封存冷凍。測定方法按大鼠MPO試劑盒(上海江萊生物公司)說明進行，單位:U/g濕片。

2.4 無復流面積 再灌注不同時間后，自右頸總動脈逆向注入1%硫磺素S 0.5 mL，再次結扎冠狀動脈，再經右頸總動脈注入2%酞菁藍溶液0.8 mL，染色均勻后取出心臟，自結扎線以下，水平切成約2 mm的薄片，熒光顯微鏡下觀察無復流區域并采集圖像，然后將缺血心肌片用0.5%TTC(pH=7.4)溶液避光孵育(37℃)15 min，采集圖像，IPP軟件分析并計算無復流和梗死心肌面積。

2.5 免疫組化染色 大鼠心肌組織石蠟切片常規脫蠟至水，檸檬酸鹽緩沖液進行抗原熱修復20 min，3%的過氧化氫封閉內源性過氧化酶，經0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液洗滌后分別加入GDF-15Ⅰ抗(按1∶300稀釋)，后續步驟按ABC法染色試劑盒操作說明進行，DAB顯色。目的切片再經蘇木素復染，脫水、透明后中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察大鼠心肌組織中細胞著色情況。每只大鼠心肌取10張切片，采用二級計分法計數陽性細胞。按陽性細胞數量計分+細胞著色程度計分，算出總分后取均值，進行統計分析。

2.6 HE染色 心肌切片經4%多聚甲醛固定24 h，常規脫水、浸蠟、包埋，制成5 μm厚石蠟切片，進行HE染色，光學顯微鏡下觀察心肌組織損傷及中性粒細胞浸潤情況。

3 統計學處理

數據用均數±標準差(mean±SD)表示，統計學處理采用GraphPad Prism 6軟件進行分析，多組間比較用單因素方差分析(One-way ANOVA)，有顯著差異者用SNK(Student-Newman-Keuls)q檢驗進行兩兩比較。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 GDF-15 mRNA及蛋白在損傷心肌組織中的表達

各時點之間，I/R組較sham組GDF-15 mRNA表達量均顯著增高，在再灌注2～24 h之間一直保持幾乎線性增長趨勢，在再灌注24 h時達到峰值，見圖1。在組織蛋白水平，I/R組各時點的GDF-15蛋白表達量也均顯著高于sham組。I/R組在再灌注后2～6 h時，GDF-15蛋白表達呈現明顯快速上調，之后趨勢稍緩，再灌注24 h時達峰值，I/R組再灌注7 d時依然維持較高表達，見圖2。

Figure 1.Up-regulation of GDF-15 mRNA in rat myocardial tissues after cardiac I/R.Mean ± SD.n=6.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs sham group at each time point.圖1 大鼠心臟I/R后心肌組織GDF－15 mRNA的表達上調

Figure 2.Immunohistochemical analyses of GDF-15 protein expression in rat myocardial tissues after cardiac I/R(× 200).Mean ± SD.n=6.＊＊ P ＜ 0.01 vs sham group at each time point.圖2 免疫組化分析大鼠心臟I/R后心肌組織GDF-15蛋白的表達

2 心肌組織MPO活性的檢測

I/R組各時點之間相比有統計學差異(P＜0.05)，且各時點MPO活性較sham組均有顯著升高，見圖3。

3 大鼠心肌染色結果

I/R組缺血面積各時點間無統計學差異(P＞0.05)，見圖4。Sham組各時點無缺血、梗死、無復流發生。I/R組，隨再灌注時間的延長梗死面積逐漸增大，但在再灌注前3個時點變化明顯。無復流面積也是在再灌注前3個時點內表現為較明顯的擴大延展趨勢，在延展進程中，擴展速度在再灌注6 h后幾乎進入平臺期，提示在再灌注6 h之內可能是減少無復流發生及梗死的關鍵，見圖5。

Figure 3.MPO activity in rat myocardial tissues after cardiac I/R determined by ELISA kit.Mean ± SD.n=6.＊＊P＜0.01 vs sham group at each time point.圖3 ELISA試劑盒檢測大鼠心臟I/R后心肌組織中MPO的活性

Figure 4.Risk area of the rat hearts after I/R in I/R group.VWA:ventricular wall area.Mean ± SD.n=6.圖4 I/R組大鼠心臟I/R后心肌缺血面積

4 MPO活性與GDF-15蛋白表達的相關性分析

由于中性粒細胞的浸潤主要在炎癥損傷發生后的24～48 h之間明顯，故取I/R組前5個時點觀察，以各時點內GDF-15蛋白表達的陽性積分均值ˉx為變量x，以各時點內MPO活性值的均值ˉy為變量y繪制散點圖。隨著GDF－15表達增高，MPO活性也隨之降低，即中性粒細胞浸潤量也趨于減少。MPO活性與 GDF-15表達呈負相關(r=－0.9895，P＜0.01)，提示GDF-15可能參與抑制無復流的發生和延展過程。

5 HE染色結果

I/R組心肌微血管內彌漫分布著中性粒細胞，周圍局部可見大片心肌凋亡壞死，其中以再灌注2 h、4 h和6 h時較明顯。在再灌注24 h后，心肌細胞大片死亡，組織間隙明顯。Sham組只在穿線部位可見輕微損傷，見圖6。

討 論

Figure 5.No-reflow and infarct areas of the rat hearts after I/R in I/R group(thioflavin S，phthalocyanine blue and triphenyltetrazolium chloride staining).In the left figures of the upper panel，fluorescence area:flow area;no fluorescence area:no-reflow area.In the right figures of the upper panel，blue:non-ischemic area;brick red:ischemic area;pale:infarct area.Mean ±SD.n=6.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs R2h.圖5 I/R組大鼠心臟I/R后心肌無復流面積和梗死面積

Figure 6.Pathological changes of rat myocardial tissues(HE staining，×200).圖6 大鼠心肌組織的病理學變化

PCI是急性心肌梗死最主要的再灌注手段，能顯著改善這類患者的近遠期預后。然而，在ST段抬高型急性心肌梗死患者行PCI術后，無復流的發生率高達約5%～50%，且與惡性心律失常、心衰、心源性猝死密切相關［6］。無復流的發生機制眾多，其中，中性粒細胞激活、浸潤、脫顆粒可能是心肌缺血再灌注損傷眾多機制的共同效應環節或途徑［7］。

GDF-15在無復流現象中的作用目前還未見研究報道。既往研究結果顯示:在小鼠心肌I/R模型中，心肌組織GDF-15可以通過PI3K/Akt1通路發揮直接抗心肌細胞凋亡作用［3］。最新研究還發現GDF-15可以顯著抑制中性粒細胞表面β2-整合素的活化從而減少中性粒細胞募集［8］。

本研究結果顯示，大鼠心肌急性缺血/再灌注后出現明顯的無復流現象，I/R組心肌梗死及梗死周邊區中性粒細胞的浸潤量和GDF-15的表達較sham組均明顯升高。這提示在無復流延展進程中，有明顯的中性粒細胞浸潤，同時伴有GDF-15的反應性高表達。在再灌注2～24 h之間，二者不僅有明顯的動態變化規律，且存在負相關，提示在大鼠急性心肌缺血再灌后無復流面積的延展中，GDF-15可能能抑制中性粒細胞浸潤，進而抑制無復流。

［1］ Kang S，Yang Y.Coronary microvascular reperfusion injury and no-reflow in acute myocardial infarction［J］.Clin Invest Med，2007，30(3):E133-E145.

［2］ Bottner M，Suter-Crazzolara C，Schober A，et al.Expression of a novel member of the TGF-β superfamily，growth/differentiation factor-15/macrophage-inhibiting cytokine-1(GDF-15/MIC-1)in adult rat tissues［J］.Cell Tissue Res，1999，297(1):103-110.

［3］ Kempf T，Eden M，Strelau J，et al.The transforming growth factor-β superfamily member growth-differentiation factor-15 protects the heart from ischemia/reperfusion injury［J］.Circ Res，2006，98(3):351-360.

［4］ 孟祥艷，宋立新，羅玉玉.大鼠心肌缺血-再灌注損傷中轉錄因子ZFP580表達的變化［J］.中國病理生理雜志，2011，27(6):1127-1131.

［5］ 姜春明，韓麗萍 ，李鴻珠.鈣敏感受體在大鼠心肌缺血/再灌注損傷的表達變化及與心肌損傷關系［J］.中國病理生理雜志，2007，23(6):1084-1087.

［6］ Rognoni A，Lupi A，Secco GG，et al.Intracoronary injection of drugs to treat no-reflow phenomenon and microcirculatory dysfunction［J］.Cardiovasc Hematol Agents Med Chem，2012，Sep 10［Epub ahead of print］.

［7］ 陳 芳，魏繼承.中性粒細胞激活在心肌缺血再灌注損傷中的作用［J］.西南軍醫，2009，11(1):117-119.

［8］ Kempf T，Zarbock A，Widera C，et al.GDF-15 is an inhibitor of leukocyte integrin activation required for survival after myocardial infarction in mice［J］.Nat Med，2011，17(5):581-588.