急性肺損傷大鼠肺組織中NF－КBp65和IL－8表達的意義及黃芪的干預作用

賀兼斌，廖慧中，向 志，易高眾，張 平 (.湖南省懷化市第一人民醫院呼吸內科，湖南 懷化 48000;.南華大學附屬第一醫院呼吸內科，湖南 衡陽 400)

急性肺損傷大鼠肺組織中NF－КBp65和IL－8表達的意義及黃芪的干預作用

賀兼斌1，廖慧中1，向 志1，易高眾1，張 平2(1.湖南省懷化市第一人民醫院呼吸內科，湖南 懷化 418000;2.南華大學附屬第一醫院呼吸內科，湖南 衡陽 421001)

目的:研究內毒素(lipopolysaccharide，LPS)誘發急性肺損傷(acute lung injury，ALI)大鼠肺組織中核因子－КBp65(nuclear factor－kappaB，NF－КBp65)和白細胞介素8(interleukin 8，IL－8)的表達，用黃芪干預，觀察和探討黃芪對ALI的治療效果及作用機制。方法:24只Wistar大鼠，隨機均分成三組。對照組，706代血漿2 ml/(kg·只)尾靜脈注射;模型組，LPS6mg/(kg·只)溶于706代血漿2 ml/(kg·只)尾靜脈注注;黃芪組，LPS用法同模型組，2 h后尾靜脈注射黃芪2 ml/(kg·只)。觀察各組動物反應，黃芪干預2 h后頸動脈快速放血處死，行動脈血氣分析，右肺稱濕重后，90℃烘箱內24 h至恒重，稱干重，計算濕/干重比(Wet weight/Dry weight，W/D)。左肺4%甲醛固定、石蠟包埋、組織切片(5 μm)，HE染色，病理觀察，免疫組化及圖像分析系統檢測NF－КB和IL－8的表達。結果:黃芪組呼吸窘迫減輕，對照組、模型組、黃芪組呼吸頻率分別為(44.2±3.5)次/min，(112.7±6.1)次/min，(71.8±4.3)次/min;血氣分析:動脈血氧分壓(PaO2)分別為(12.51±0.38)kPa，(9.01±0.72)kPa，(11.27±0.51(kPa;二氧化碳分壓(PaCO2)分別為(4.07±0.17)kPa，(4.60±0.41)kPa，(4.30±0.43)kPa;PH 值分別為(7.39±0.04)kPa，(7.33±0.14)kPa，(7.35±0.08)kPa。肺濕/干比分別為(5.1±4.3)，)11.3±3.8)，(7.8±3.6)。模型組肺組織有典型的 ALI病理學改，黃芪干預后，病理學改變較模型組輕。NF－КBp65表達的灰度值分別為(169.4±6.57)，(107.6±5.81)，(148.3±6.47)，IL－8表達的灰度值分別為(181.6±7.18)，(122.4±5.27)，(154.1±6.39)。結論:ALI大鼠肺組織中NF－КBp65和IL－8表達明顯升高，ALI的發病機理可能與NF－КBp65和IL－8表達升高所致的炎性反應調控失衡有關;黃芪對大鼠ALI有明顯的治療效果，可能與其下調NF－КBp65和IL－8表達有關。

核因子－КB;白細胞介素8;急性肺損傷;急性呼吸窘迫綜合征;黃芪

ALI是呼吸系統的危重病，病死率很高，嚴重威脅患者生命，ALI的防治是醫療領域的一項重大難題，其發病機理復雜，迄今尚未能完全闡明，近年認為它與炎癥調控失衡有密切關系，其中NF－КB對許多參與免疫與炎性反應的基因表達起調控作用，IL－8對多形核白細胞(poly－morphonuclear leukoeytes，PMN)有趨化作用，是重要促炎因子和組織損傷的炎性介質，研究表明它們與ALI炎性反應調控失衡有關［1－2］。黃芪對ALI有一定治療作用［3］，但具體機制不清。本研究用LPS誘發ALI動物模型，檢測ALI大鼠肺組織NF－КBp65和IL－8表達，采用黃芪干預治療，觀察并探討黃芪對ALI的治療作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物:雄性Wistar大鼠24只，體重(300±50)g左右，由南華大學醫學實驗動物部提供［生產許可證號:SCXK(湘)2004－0009，使用許可證號:SYXK(湘)2004－0011］。

1.2 藥品及主要試劑:黃芪注射液(批號:Z51021776，每支10 ml，相當于20 g生藥)由成都地奧九泓制藥廠提供，內毒素脂多糖(E.coli O111B)購于美國Sigma公司，NF－КBp65兔抗鼠單抗及SABC試劑盒購于武漢博士德公司，IL－8兔抗鼠單抗及即用型SABC試劑盒由長沙瑞晶公司提供，DAB顯色劑均購自福州邁新生物工程公司。

1.3 動物模型建立:2%戊巴比妥鈉(45 mg/kg)腹腔注射麻醉，LPS(6 mg/kg)溶于706代血漿尾靜脈注射誘發ALI動物模型。

1.4 分組及用藥:24只Wister大鼠，隨機均分成三組，對照組:706代血漿2 ml/(kg·只)尾靜脈注射;模型組:LPS 6 mg/kg/只溶于706代血漿2 ml/(kg·只)尾靜脈注射;黃芪組:LPS同模型組，2 h后腹腔注射黃芪2 ml/(kg·只)。5 h后，2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，頸動脈取血備用、處死。

1.5 觀察指標及方法

1.5.1 動物反應觀察:觀察各組動物呼吸頻率，活動情況，口唇及四肢末端紫紺變化情況，鑒定動物模型。

1.5.2 血氣分析:實驗結束后頸動脈放血處死，用澳大利亞產348Ph/Blood Gas Analyzer測動脈血 PH值，血氧分壓(PaO2)，二氧化碳分壓(PaCO2)等。

1.5.3 剖胸取右肺稱濕重后，置90℃烘箱內24 h至恒重，稱干重，W/D。

1.5.4 光鏡觀察:左肺用4%中性甲醛溶液固定、石蠟包埋、組織切片(5 μm)，HE染色，病理觀察。

1.5.5 免疫組化:免疫組化SABC法檢測NF－КBp65和IL－8的表達。操作嚴格按試劑盒說明書進行，用PBS緩沖液代替一抗作陰性對照。NF－КBp65主要表達于胞漿，胞核少量表達，為棕黃色顆粒;IL－8主要表達于單核細胞、巨噬細胞和內皮細胞胞漿，呈棕黃色顆粒，采用Luzex－F病理圖像分析系統測定肺組織中NF－КBp65和IL－8的平均灰度值(灰度值與蛋白質表達水平負相關)。

2 結果

2.1 各組大鼠的一般表現:對照組精神佳，呼吸平穩，RR40～50次/min，無紫紺。模型組注射LPS 5 min后即出現呼吸加快，45 min后RR110～120次/min，活動減少，煩躁不安，發紺，呼吸窘迫，模型成功。黃芪組注射LPS后表現同模型組，黃芪干預后，紫紺減輕，RR下降，各組比較差異有統計學意義(P＜0.01)，具體情況見表1。

2.2 黃芪對肺濕、干重和W/D的影響:與對照組相比，模型組肺濕、干重和W/D顯著增加(P＜0.01);黃芪組以上指標明顯降低(P＜0.05)，但高于對照組，見表1。

表1 處死前各組大鼠呼吸情況及處死后肺濕、干重和W/D比較±s)

表1 處死前各組大鼠呼吸情況及處死后肺濕、干重和W/D比較±s)

注:與對照組比較，①P＜0.01;與模型組比較，②P＜0.01;與模型組比較，③P＜0.05

組別 例數處死前RR 肺濕重(mg) 肺干重(mg)W/D對照組8 44.2±3.5 697.3±11.5 147.7±24.7 5.1±4.3模型組8 112.7±6.1①1564.72±26.3① 170.5±18.2① 11.3±3.8①黃芪組8 71.8±4.3①③1130.1±13.0①③152.3±17.5①②7.8±3.6①②

2.3 肺組織形態學觀察:對照組肺無明顯異常改變，鏡下肺泡結構清晰;模型組肺暗紅色，體積增大，高度充血，水腫，較多出血灶，鏡下見出血，肺泡壁增厚，間質水腫，大量炎性細胞浸潤;黃芪干預后，病理改變較模型組明顯減輕，見圖1～2。

2.4 血氣分析:模型組PaO2明顯低于對照組(P＜0.01)，經黃芪干預后，PaO2上升，黃芪組與模型組PaO2比較差異有統計學意義(P＜0.05)，模型組及黃芪組PaCO2較正常對照組上升(P＜0.05)，但模型組與黃芪組間比較，差異無統計學意義(P＞0.05)，模型組和黃芪組出現呼吸性酸中毒，pH值下降，與正常對照組比差異有統計學意義(P＜0.05)，見表2。

2.5 NF－КBp65和IL－8的表達:對照組NF－КBp65在胞漿中少量表達，細胞核基本不表達，模型組胞漿和胞核都有廣泛高表達，黃芪組NF－КBp65在胞漿和細胞核表達比模型組有明顯下降，見圖3～4，表2;IL－8主要表達于單核細胞、巨噬細胞和內皮細胞胞漿，其表達情況與NF－КBp65類似，見圖5 ～6，表2。

表2 各組血氣分析和NF－КBp65、IL－8灰度值的比較(±s)

表2 各組血氣分析和NF－КBp65、IL－8灰度值的比較(±s)

注:與對照組比較，①P＜0.01;與對照組比較，②P＜0.05;與模型組比較，③P＜0.05

組別 例數 PaO2(kPa) PaCO2(kPa) PH值 NF－КBp65灰度值 IL－8灰度值對照組 8 12.51±0.38 4.07±0.17 7.39±0.04 169.4±6.57181.6±7.18模型組 8 9.01±0.72① 4.60±0.41① 7.33±0.14② 107.6±5.81① 122.4±5.27①黃芪組 8 11.27±0.51①③ 4.30±0.43① 7.35±0.08② 148.3±6.47①③ 154.1±6.39①③

圖1 模型組病理觀察(HE×200)

圖2 黃芪組病理觀察(HE×200)

圖3 模型組NF－КBp65表達(SABC×

圖4 黃芪組NF－КBp65表達(SABC×400)

圖5 模型組IL－8表達(SABC×400)

圖6 黃芪組IL－8表達(SABC×400)

3 討論

ALI發生和發展存在過度失控的炎性反應，其病理改變伴有PMN滲出、趨化、聚集并與血管內皮細胞黏附，釋放大量炎癥介質，導致肺血管內皮損傷，通透性增加，水分、蛋白質聚集于肺間質和肺泡內，引起肺順應性降低，通氣/血流比例失調，低氧血癥等改變。細胞因子的過度表達及其相互作用是發生ALI的重要原因，調控機體炎性反應是治療ALI的根本手段，NF－КB參與許多細胞因子及炎性介質基因的轉錄調控，在炎性反應調節中起重要作用，與肺損傷的關系逐漸引起重視［1］。IL－8是一個促炎因子，是強有力的PMN趨化和激活劑，參與ALI炎性反應，與ALI的發生和進展密切相關［2］。黃芪在臨床上已廣泛應用于多種疾病的治療，本課題組前期研究提示能減輕LPS所致ALI大鼠模型肺損傷［3］。

結合大鼠呼吸變化、紫紺情況、血氣分析、肺W/D變化、肺臟大體標本改變及病理改變，ALI模型是成功的［1－3］。我們對ALI大鼠給予黃芪干預后，其病理學改變較模型組明顯減輕，肺W/D明顯下降，血氣改善，證明黃芪能減輕ALI肺損傷，對ALI有明顯治療作用。NF－КB是一種轉錄核因子，一般表達于胞漿，當被內毒素、活性氧、細胞因子等激活后從胞漿轉位于胞核，啟動靶基因轉錄，調控多種基因表達，產生大量炎性介質及細胞因子參與ALI的炎性反應進程，在炎性反應基因調控過程和細胞因子級聯反應中起重要作用［4－6］。有研究表明在急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory disress syndrome，ARDS)高危患者和ARDS患者以及小鼠肺損傷模型中存在 NF－ КB 活性增高［7－8］，NF－ КB 活化后，調控炎性介質和細胞因子，在上游調控ARDS炎性反應，成為炎癥調節的樞紐和關鍵，亦有研究顯示在ALI動物模型中，抑制NF－КB的活性可以減輕急性肺損傷［9］。筆者的研究顯示對照組大鼠肺組織中NF－КB呈低表達于胞漿，而模型組肺組織胞漿及胞核內見分布均勻的棕色顆粒，大多數已進入細胞核，即胞漿和胞核均呈高表達狀態，經黃芪干預后，NF－КBp65活化程度明顯低于模型組，其在胞核的表達減少尤為明顯。利用病理圖象分析系統對NF－КBp65蛋白表達進行灰度掃描，對照組中NF－КBp65灰度值最高，NF－КBp65表達水平低，而模型組NF－КBp65表達的灰度值最低，與對照組比較差異有統計學意義(P＜0.01)，表明NF－КB存在異常激活，處于高度活化狀態，較多細胞胞核呈陽性表達，其功能可異常增高，進而改變細胞信號轉導，促進炎性反應，加重肺損傷。黃芪組NFКBp65表達的灰度值介于模型組和對照組之間，它們與對照組和模型組比較差異有顯著統計學意義(P＜0.01)，說明黃芪可通過下調NF－КB的表達，減輕肺損傷，對ALI有治療作用。IL－8為前炎性反應介質，它主要由單核細胞、內皮細胞和巨噬細胞產生，IL－8能促進PMN趨化和激活，促使PMN在肺部浸潤、氣道內聚集，導致細胞變形、脫顆粒、呼吸爆發、釋放溶酶體、形成超氧化物，擴大炎性反應，增加肺泡－毛細血管損傷［10］。在我們的研究中發現正常大鼠肺組織中IL－8呈低表達于胞漿，而模型組大鼠肺組織胞漿內見分布均勻的棕色顆粒，呈高表達狀態，黃芪組肺組織IL－8含量顯著少于模型組，利用病理圖象分析系統對IL－8蛋白表達進行灰度掃描后，對照組中IL－8灰度值最高，表達水平低，模型組IL－8表達的灰度值最低呈高表達狀態，與對照組比較差異有統計學意義(P＜0.01)，黃芪組IL－8表達的灰度值介于模型組和對照組之間，它們與對照組和模型組比較差異均有統計學意義(P＜0.01)，提示黃芪可調控IL－8表達，其對肺的保護作用，與IL－8表達降低有一定關系。黃芪是我國的傳統中藥材，在體實驗表明［11－12］，黃芪有抑制損傷和炎性反應后脂質過氧化及增強免疫功能，我們的研究表明黃芪可抑制損傷后機體NF－KB的激活，減輕炎性反應。早有研究表明［13］，ARDS患者BALF中IL－8顯著升高，PMN明顯增加，導致肺泡－毛細血管膜損傷，大量蛋白及細胞成分滲透到肺血管外，促進肺水腫，IL－8水平與PMN相對含量正相關，與ARDS的發生和死亡率正相關，這一結論與我們的動物實驗相一致。

綜上所述，防止NF－КB和IL－8的過度激活或抑制其活性已經成為治療ALI的新途徑之一，黃芪能下調NF－КB和IL－8的表達，對ALI的治療有重要意義，但IL－8為NF－КB的下游因子［14］，黃芪是通過下調NF－КB的表達從而降低IL－8的表達，還是對兩者皆有抑制作用，倘不完全明了，有待進一步研究。

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Meaning of expression of NF－К Bp65 and IL－8 on pulmonary tissue in ALI rat model and intervention effect of astragalus mongholicus

HE Jian － bin，LIAO Hui－ zhong，XIANG Zhi，et al.(Department of Pneumology，the First Hospital of Huaihua City，Huaihua 418000，China)

Objective To study the expression of NF－К Bp65 and IL－8 on pulmonary tissue in ALI rat model induced by injectingLPS，and to use the astragalus mongholicus to carry on the intervention treatment to observe and discuss the treatment result of astragalus mongholicus to ALI and its function mechanism.Method 24 Wistar rats were randomized into 3 groups，each group was 8:the comparison group:706 substitute of blood plasma 2ml/kg tail intravenous injection(iv);the model group，LPS 6mg/kg dissolves into 706 substitute of blood plasma 2ml/kg tail iv;the astragalus mongholicus group，the LPS usage with the model group，after 2 hours astragalus mongholicus 2ml/kg iv;All rats were sacrificed by bloodletting after 2 hours after treatment.with the artery blood for blood gas analysis，took the right lung to call Wet weight，and set to the 90℃ drying oven 24 hours to the constant weight，called its dry weight，calculated the wet/dry weight ratio，Left lungs were processed for histological examination.the expression of NF－ К Bp65 and IL－8 in the lung tissue were detected by immunhistochemical method and pathology image analysis system.Results 1，Astragalus mongholicus treatment group was able to reduce the breath poverty－ stricken，the breathe frequency were44.2 ±3.5，112.7 ±6.1，71.8 ±4.3，respectively in the comparison group，the model group，the astragalus mongholicus group;2，Blood gas analysis:PaO2(kPa)were 12.51 ±0.38，9.01 ±0.72，11.27 ±0.51，respectively.PaCO2(kPa)were4.07 ±0.17，4.60 ±0.41，4.30 ±0.43，respectively;Ph were7.39 ±0.04，7.33 ±0.14，7.35 ±0.08，respectively;3，W/D were 5.1 ±4.3，11.3 ±3.8，7.8 ±3.6，respectively;4，lung tissue of model group had a typical ALI pathological change;astragalus mongholicus intervention group pathology change was lighter compared with the model group;5，the expression of NF － КBp65 grey respectively was 169.4±6.57，107.6 ±5.81，148.3 ±6.47，and the expression of IL －8 grey respectively was 181.6 ±7.18，122.4 ±5.27，154.1±6.39.Conclusion The expression of NF － КBp65 and IL －8 on lung tissue in ALI rats is obviously elevates，astragalus mongholicus has the obvious treatment works result to ALI rat，and it is possibly related to its effect of suppressing the expression of NF －КBp65 and IL－8.

Nuclear factor－kappaB;Interleukin 8;Acute lung injury;Acute respiratory distress syndrome;Astragalus mongholicus

衡陽市科委科研基金資助［項目編號:2005KS01－011］

2012－06－28 編校:潘宏竹］