果葡糖漿生產過程中甘露糖產生的研究

劉 佳， 張曉萍， 段 鋼

（杰能科（中國）生物工程有限公司 杜邦工業生物科技，江蘇 無錫 214028）

果葡糖漿是由果糖和葡萄糖及其它少量的糖類所組成的混合物，是一種以淀粉為主要原料、運用生物工程技術生產出來的健康型糖源[1]。果葡糖漿主要應用于食品工業，也有少量高純果糖可應用于醫藥工業。在食品工業中主要應用于軟飲料行業、乳制品行業、罐頭工業、糕點行業等。隨著對果葡糖漿優越性的深入了解，其應用領域更加廣泛，國內外市場需求量也在不斷增加，質量要求也越來越高。

作者在分析客戶樣品過程中發現在一些果葡糖漿中存在一定量的甘露糖，所占比例從0.2%到1.5%不等。根據可口可樂公司對F55型果葡糖漿的質量要求，即果糖最小含量為55%，果糖與葡萄糖含量不小于95%。在一些F55果糖樣品中，由于存在甘露糖，雖然果糖含量滿足要求，單糖含量也在95%以上，但果糖與葡萄糖含量之和小于95%。由于可口可樂公司的要求中并不是指單糖含量，因此這種產品實際上是不符合要求的。由于F55果糖是由F90果糖和F42果糖混配而成，為了滿足要求就需要提高F90的比例。因此研究果葡糖漿生產過程中甘露糖產生的原因具有重要意義。

通過仔細分析含有甘露糖的樣品后發現，其主要產生在兩個過程之后，一個是在異構化之后，另一個是在第二次離子交換之后，即F42果糖離交后。葡萄糖異構酶的來源較多，商業化的酶主要來源于Bacillus和streptomyces[2]，可以催化葡萄糖、果糖，木糖、木酮糖之間的異構反應。由于對葡萄糖異構酶的研究多集中在底物特異性及提高反應穩定性等方面，因而對副反應產物的報道很少。此外果糖、葡萄糖易在堿性條件下，由于旋光改變作用發生分子重排和降解，通過烯二醇作為中間物可以實現果糖、葡萄糖和甘露糖之間的互相轉化[3-4]，此反應又稱為Lobry de Bruyn-Alberda van Ekenstein轉化，并且在此過程中單糖部分降解，產生少量有色物質等其它產物。而在生產過程中，果葡糖漿需要使用離子交換樹脂進行純化，離子交換樹脂使用堿液進行再生，再生后清洗不徹底，容易造成局部過堿，從而發生此反應生成甘露糖。

作者研究了葡萄糖異構酶對甘露糖產生的影響，以及葡萄糖、果糖在不同堿性pH值條件下單糖旋光改變和降解反應的情況，比較了不同環境下葡萄糖和果糖含量變化對甘露糖產生的影響，同時檢測了反應體系中產生的其它產物。為研究果葡糖漿中甘露糖和其它雜質的產生原因提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

葡萄糖，果糖，氫氧化鈉和硫酸：國藥集團產品；葡萄糖，果糖，甘露糖，甲酸，乙酸，乙酰丙酸，糠醛和5-羥甲基糠醛：Sigma公司產品；異構酶1和異構酶2：市售。

1.2 實驗方法

1.2.1 異構酶對甘露糖產生的影響 25 g葡萄糖漿（客戶樣品，質量分數45%，pH 7.4，Mg2+質量濃度45 mg/kg）中加入2 g異構酶，于60℃水浴保溫，分別于24 h及48 h取樣分析。對照實驗以分析純葡萄糖加蒸餾水配置成相同濃度的糖漿，并調節pH及鎂離子質量濃度相同，加入同樣比例異構酶，60℃反應，于24 h和48 h取樣分析。

1.2.2 不同堿性pH值條件下果糖及果糖和葡萄糖混合物的反應 用分析純果糖和葡萄糖加水配成100 g/L 3種溶液，溶液中果糖濃度分別為100%、42%和20%。分別取10 mL上述溶液加入50 mL塑料離心管中，并加入10 mL不同濃度的NaOH溶液，使最終溶液體系成為6個不同pH值的50 g/L 100%果糖、42%果糖和20%果糖溶液。6個pH值分別 為 pH 7，pH 8.5，pH 10，pH 11，pH 12 和 pH 12.8。將離心管蓋上蓋子后放入60℃水浴進行反應，在0，4，7和23 h分別進行取樣分析。

1.3 分析方法

1.3.1 葡萄糖，果糖和甘露糖分析 使用帶有示差檢測器的安捷倫1260 HPLC系統進行分析，色譜柱：Phenomenex RezexTMCalcium Monosaccharide（RCM）（300×7.8 mm）；柱溫 80 ℃；流動相純水；流量0.6 mL/min；示差檢測器溫度40℃。

1.3.2 有機酸分析 使用帶有示差檢測器的安捷倫1100 HPLC系統進行分析，色譜柱：Phenomenex RezexTMOrganic Acid （300 mm×7.8 mm）； 柱溫 60℃；流動相 0.005 mol/L H2SO4；流量 0.6 mL/min；示差檢測器溫度30℃。

1.3.3 反應體系吸光度分析 使用分光光度計在420 nm處測定樣品的A值。

2 結果與討論

2.1 異構酶對甘露糖產生的影響

以客戶的異構進料樣為底物，其中葡萄糖質量分數為91.38%，考察了葡萄糖異構酶對甘露糖產生的影響，結果顯示，底物自身幾乎不含甘露糖，當糖液中不添加葡萄糖異構酶，24 h后僅有微量甘露糖產生，而加入葡萄糖異構酶24 h后，生成大量甘露糖。通常認為甘露糖是果糖在堿性條件下通過Lobry de Bruyn-van Ekenstein途徑產生，也有研究認為在中性或酸性條件下，果糖也能夠轉化為甘露糖，但需要較長時間。在工業生產中，果糖異構反應的pH通常控制在7.3附近，此時果糖的Lobry de Bruyn-van Ekenstein轉化速率慢，因此添加異構酶后所產生的甘露糖僅有極小部分是通過此反應產生，大部分應來源于異構酶的副反應活力。

為了進一步了解異構酶對甘露糖產生的影響，實驗使用了兩種商品化的異構酶，考察其影響，結果如圖1所示。異構酶1和異構酶2是兩種商業化多年的葡萄糖異構酶產品，從圖1可以看出兩者在異構過程中都會產生甘露糖。對于異構酶1，反應24 h后，甘露糖增加3倍，24 h后雖然甘露糖濃度仍然在增加，但速度減慢。對于異構酶2，24 h后甘露糖增加了3.4倍，同樣其產生速度也在24 h后大幅降低。果糖與甘露糖的比值在一定程度上反應了異構酶對于主反應的選擇性，由于兩種異構酶產生甘露糖的能力有所不同，從而表現在主反應的選擇性上也有所區別。但這種區別在底物被更換為分析純葡萄糖配制的糖漿時表現的不明顯。以分析純葡萄糖為底物，反應24 h甘露糖的產生量減少了30.3～33.7%（圖2），而果糖與甘露糖的比值則提高41.5～51.0%，由此可見提高底物純度不僅能夠降低甘露糖產生，也有利于提高異構反應的選擇性。

圖1 不同異構酶對甘露糖產生的影響Fig.1 Effect of different glucose isomerase on mannose formation

圖2 以葡萄糖為底物時甘露糖的產生Fig.2 Mannose formation using glucose as substrate

果葡糖漿的生產是一個連續的過程，葡萄糖漿從異構柱進口進入，到F42果糖從出口流出的線速度通常為幾毫米/秒[5]，所需時間并沒有24 h，因此在正常的生產中，并不會有太多的甘露糖在異構之后產生。但果糖生產存在淡、旺季之分，在淡季，工廠通常會封柱，或是將流速降至極低，這樣就使得酶與糖漿的接觸時間大大增加，因此在剛恢復正常流量時，會在異構出口處的樣品中檢測到較多的甘露糖。此外有些工廠在將異構酶裝填進異構柱之前，會先對酶進行水化，水化時間通常需要數小時，也會產生一定量的甘露糖。

2.2 不同堿性pH值對果糖及果糖和葡萄糖混合物反應的影響

2.2.1 不同堿性pH值對甘露糖合成的影響 為了研究離子交換樹脂中殘留堿液對甘露糖產生的影響，作者使用質量分數100%果糖和42%、20%果糖含量的果葡糖漿作為底物，觀察其在不同堿性pH條件下甘露糖的合成情況，結果如圖3所示。

圖3 不同pH值對甘露糖產生的影響Fig.3 Effect of different alkali pH values on mannose formation

以質量分數100%果糖作為反應底物時，在pH 7～10條件下反應體系只有微量甘露糖合成（甘露糖含量小于0.1 g/L）。當pH大于10后，甘露糖含量大幅提高，尤其在4 h后。當pH為12.8反應4 h后，甘露糖含量接近7 g/L。以質量分數42%果糖的果糖和葡萄糖混合物作為反應底物時，在pH 7～10條件下，在取樣時間內沒有明顯甘露糖合成，當pH大于11后，0 h的樣品中可檢測到甘露糖。當pH為12.8，0 h的樣品中可測得1.5 g/L左右甘露糖，反應4 h以后，其含量達到6 g/L，這與相同條件下質量分數100%果糖作為底物時相比略低。而以質量分數20%果糖含量的混合物作為底物時，產生的甘露糖變化曲線與另外兩種底物類似，但甘露糖合成量比質量分數42%果糖含量的底物更低一些。由此可見，甘露糖的產生與環境pH值和接觸時間密切相關，環境pH越高，果糖產生甘露糖的時間越短，當pH大于11后，接觸瞬間既有少量甘露糖產生，因此在離子交換過程中，如果樹脂堿性再生后沒有清洗干凈，造成局部pH過高，糖漿接觸之后就會產生甘露糖，因此樹脂再生后清洗干凈有助于減少離子交換過程中甘露糖的產生。

2.2.2 不同堿性pH值對其它雜質 （有機酸和有色物質）合成的影響 上述果糖和葡萄糖體系在反應23 h時測定其pH值發現均有一定程度的下降，且均可降至pH 7以下。單糖在酸性條件下易發生降解反應產生有機酸及其它一些產物，其中有些降解產物，如糠醛、5-羥甲基糠醛（5-HMF）會影響果葡糖漿的風味，因此除甘露糖含量外，作者還測定了上述底物在不同pH條件下23 h時反應體系中甲酸、乙酸、乙酰丙酸、糠醛和5-HMF的含量，測定結果如圖4所示。

圖4 不同pH值下反應23 h對有機酸合成的影響Fig.4 Effect of different alkali pH values on organic acid formation after 23 hours

通過實驗結果可以發現上述反應體系中無乙酰丙酸和糠醛檢出。100%果糖和42%果糖作為反應底物時，甲酸在初始pH大于7的反應體系中均可產生；20%果糖作為反應底物時，甲酸在初始pH大于10以后才開始合成。在初始pH為12.8時3種不同果糖含量反應底物的甲酸含量接近，可達1.5 g/L。3種不同果糖含量反應底物均在初始pH大于11后才開始合成乙酸，且3種反應底物在初始pH為12.8時乙酸合成量非常接近，均可達1.6 g/L。在初始pH大于12時5-HMF開始合成，且100%果糖在初始pH為12.8時5-HMF含量最高，可超過0.05 g/L。3種有機酸的合成量均隨果糖比例的增加而增加。這是由于葡萄糖降解較為困難，且需要金屬離子作為催化劑，甲酸、乙酸和5-HMF主要為果糖降解產物。果糖的主要降解產物是5-HMF，但5-HMF并不穩定，在一定條件下也會發生低聚或進一步降解成乙酰丙酸和甲酸。乙酰丙酸也不穩定，容易生成γ-內酯[6]。因此反應體系中檢測到的5-HMF含量較低，且無乙酰丙酸檢出。

果糖和葡萄糖在高pH條件下溶液顏色會發生一定變化，圖5為3種不同果糖含量的反應底物在不同pH條件下顏色變化曲線。使用分光光度計檢測反應體系的A420nm，可以發現3種果糖含量的反應底物的顏色變化非常接近，有色物質在pH大于11時才開始合成，隨著pH的增加反應體系顏色明顯加深。

圖5 不同pH值下反應23 h對體系顏色變化的影響Fig.5 Effect of different alkali pH values on color change of the system after 23 hours

3 結語

作者對果葡糖漿生產過程中甘露糖產生的原因進行研究，證實了葡萄糖異構酶和堿性環境均可能導致甘露糖產生。使用兩種不同的商品化異構酶發現異構過程都會產生甘露糖；并通過比較客戶異構進料樣和純葡萄糖漿兩種底物，發現高純度底物有助于降低甘露糖產生，另外糖漿與異構酶接觸時間過長也是甘露糖產生的一個重要原因。在研究不同堿性pH環境對果糖和果糖葡萄糖混合物影響時發現將pH降至10以下可有效降低甘露糖產生并且較高的果糖比例也會提高甘露糖的合成。除甘露糖外，在堿性pH環境中果糖和果糖葡萄糖混合物還會產生少量甲酸、乙酸、5-HMF等有機酸雜質和一些有色物質。

[1]張力田，高群玉.淀粉糖[M].北京：輕工業出版社，2011.

[2]Snehalata H Bhosale，Mala B Rao，Vasanti V Deshpande.Molecular and industrial aspects of glucose isomerase[J].Microbiological Reviews，1996，60（2）：280-300

[3]王鏡巖，朱圣庚，徐長法.生物化學[M].北京：高等教育出版社，2005.

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[5]段剛，陸冬佳，周紅偉，等.果糖生產中的問題探討.全國果葡糖漿市場與發展高峰論壇論文匯編[C].北京：2012.

[6]李艷，魏作君，陳傳杰，等.碳水化合物降解為5-羥甲基糠醛的研究[J].化學進展，2010，22（8）：1603-1609.LI Yan，WEI Zuo-jun，CHEN Chuan-jie，et al.Praparation of 5-Hydroxy methylfurfural by dehydration of carbohydrates[J].Progress in Chemistry，2010，22（8）：1603-1609.（in Chinese）