實時監測溶酶體光損傷誘導細胞凋亡過程中Bax定位的時空變化＊

劉 鐳，張真真

(華南師范大學生物光子學研究院激光生命科學研究所、暨激光生命科學教育部重點實驗室，廣東廣州 510631)

光動力療法(Photodynamic therapy，PDT)已成為治療腫瘤的一項常規手段，具有創傷小、毒性低、選擇性和適用性好、可重復治療、可協同手術提高療效等多個優點［1-4］。PDT的作用基礎是光動力效應，這是一種由氧分子參與的光敏化反應［5-6］。N-aspartyl chlorin e6(NPe6)是一種定位于溶酶體的新一代光敏劑，其光敏化效應能特異性損傷溶酶體，進而引發細胞凋亡［7-11］。

細胞凋亡(apoptosis)是一種普遍的生理現象，它是指在一定的生理或病理條件下，為了維持機體的完整性和自身穩態，各種細胞自發的程序性死亡過程［12］。眾多研究表明，Bax是關鍵的促凋亡因子，能夠觸發線粒體凋亡途徑誘導細胞凋亡。在靜息狀態下，Bax以單體非激活形式分布在胞漿中，在有凋亡刺激因子誘導的情況下，它會被刺激活化轉運到線粒體發揮促凋亡的功能［13-15］。

本研究工作中，為了在活細胞內進一步探討溶酶體光損傷誘導細胞凋亡的分子機制，我們應用熒光探針GFP-Bax檢測Bax在細胞內的動態變化。利用熒光成像在亞細胞水平對Bax轉位線粒體的動力學特征進行了實時分析。因而，我們在無損傷、活細胞生理條件下實時、直觀、可視地研究了溶酶體光損傷誘導的細胞凋亡過程，獲得了Bax在該凋亡信號通路中的動態行為特性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系及試劑 人類肺腺癌細胞系(ASTC-a-1)由暨南大學醫學院藥學系提供。小牛血清和培養基 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle medium)購于英國GIBCO公司;轉染試劑LipofectamineTM熒光染料Mito Tracker Red及 Acridine Orange(AO)均購自美國Invitrogen公司。

1.1.2 主要儀器 激光共聚焦掃描顯微鏡(LSM510/ConfoCor2，Zeiss，Germany)，微型 CO2細胞培養箱(Tempcontrol 37-2 digital，Zeiss，Germany)。

1.2 方法

1.2.1 質粒及其構建 質粒 GFP-Bax是在全長Bax的 N端融合了 GFP，由 R.J.Youle博士惠贈(National Institute of Heath，Bethesda，MD，USA)。

1.2.2 細胞培養及轉染 細胞培養液為 DMEM，添加10%小牛血清(FCS)，100 units/mL青霉素和100μg/mL的鏈霉素。人肺癌細胞用胰蛋白酶消化，轉至細胞培養皿，培養24 h左右，使細胞匯合30%-50%，使用Lipofectin試劑轉染，步驟如下:首先取兩只 Eppendorf管:一只加入 0.2 ～0.4μg 質粒和100μL無血清DMEM培養基;另一只加入2～2.5μL Lipofectin試劑和100μL無血清DMEM培養基，室溫靜置30～45 min，然后將上述兩管輕輕混勻，室溫靜置10～15 min，用無血清DMEM培養基清洗細胞一次，加0.8mL無血清DMEM培養基于上述的Lipofectin-DNA混合物中，輕輕混勻，加到細胞表面，培養5～24 h后用含小牛血清的DMEM培養基換掉上述轉染液，培養24～48 h后即可用于檢測。

1.2.3 激光共聚焦掃描顯微鏡成像檢測 實驗樣品的熒光成像均在Zeiss公司LSM 510型激光共聚焦掃描顯微鏡上完成，采用Plan-Neofluar 40×/1.3 NA油鏡對細胞進行激光共聚焦成像。GFP選用488 nm的氬離子激光作為激發光源，GFP的吸收濾色鏡選用BP500-550。

1.2.4 光動力誘導細胞凋亡 細胞在正常條件下避光孵育光敏劑NPe610 h，濃度33μmol/L.然后用PBS清洗光敏劑，更換正常的培養基。激光輻照參數為:半導體激光器(635 nm，NL-FBA-2.0-635)，輻照劑量為4 J/cm2，輻照功率為10 mW/cm2。

1.2.5 數據分析 記錄的圖像和數據均用Zeiss Rel3.2圖象處理軟件(Zeiss，Germany)對圖象上所選定的區域進行熒光強度定量分析。所有實驗均進行了n≥3次重復，同時重復對多個細胞的實驗數據進行了分析。

2 結果

2.1 光敏劑NPe6在ASTC-a-1細胞中的定位

圖1 光敏劑NPe6的亞細胞定位Fig.1 Localization of NPe6 in ASTC-a-1 cells.ASTC-a-1 cellswere loaded with 33μmol/L NPe6 and 0.5μmol/LAO.NPe6(left panel)and AO fluorescence(middle panel)were visualized by confocal microcopy.The overlay fluorescence image(right panel)of NPe6 and AO indicates that NPe6 is primarily localized in the lysosomes in ASTC-a-1 cells.Scale bar=10μm

我們應用激光共聚焦掃描顯微鏡來檢測光敏劑NPe6的亞細胞定位。AO用來特異性標記溶酶體。結果顯示:光敏劑與AO的熒光成像有很好的重合(圖1)。證明光敏劑特異性定位于溶酶體。

2.2 溶酶體光損傷誘導Bax轉位線粒體

圖2 NPe 6-PDT誘導細胞凋亡過程中Bax轉位到線粒體的動態變化Fig.2 Dynamics of Bax translocation to mitochondria during NPe 6-PDT-induced apoptosis

為了檢測Bax活化后的動態行為，實驗中將質粒GFP-Bax轉染進ASTC-a-1細胞，通過對GFP的熒光成像追蹤Bax在細胞內的運動。同時用Mit Tracket Red標記線粒體形態，根據GFP和 Mit Tracket Red的熒光重疊情況來判別Bax是否轉位到線粒體。結果顯示，在對照組，凋亡未發生，Bax主要分布在胞漿內，線粒體呈細長的線狀或樹枝狀，散布在細胞質內，可以明顯看出Bax沒有聚集在線粒體上(圖2A)。而凋亡發生后，可以明顯看到線粒體分布在細胞核周圍，Bax明顯定位，GFP和 Mit Tracket Red熒光成像的重疊顯示Bax定位在線粒體上，證明溶酶體光損傷誘導了Bax從胞漿內轉位到了線粒體(圖2B)。通過定量分析線粒體富集區域GFP的熒光強度隨時間變化的關系(圖 3)，也證實在此過程中，Bax逐步轉位到了線粒體。動力學特征顯示，一旦凋亡發生，Bax迅速轉位線粒體，在30 min內便能完成。

圖3 NPe 6-PDT誘導細胞凋亡過程中Bax轉位到線粒體量化分析Fig.3 Quantification of Bax translocation to mitochondria after NPe 6-PDT treatment.Each curve represents an average of 12-15 cells obtained from 3 independent experiments.Bax-GFP fluorescence intensity in each curve at the first time point is normalized to 100 and the time of the onset of Bax-GFP redistribution is set to zero.Data represent the mean±SEM

3 結論

近年來，我們實驗室致力于發展單分子實時檢測手段在活細胞內研究蛋白分子的動態變化［16-17］。本研究中，我們在活細胞內實時監控溶酶體光損傷誘導細胞凋亡過程中Bax亞細胞定位的動態變化。結果表明，光敏劑NPe6特異性定位于溶酶體(圖1)。溶酶體光損傷后約170 min，Bax開始轉位到線粒體，其過程非常迅速，在30 min之內便大量聚集在線粒體上(圖2，圖3)。該研究結果實時動態地展示了細胞凋亡過程中Bax的時空變化過程，為研究靶向溶酶體的光動力治療提供理論參考。

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