658 nm低能量激光照射對人牙周膜細胞生物學效應的影響＊

關為群，楊 賓，王瑜華

(1.福建醫科大學附屬協和醫院，福建福州 350001;2.醫學光電科學與技術教育部重點實驗室，福建師范大學激光與光電子技術研究所，福建福州 350007)

激光在口腔醫學中應用已成為一個新的研究方向。早期有關激光治療牙周病的研究局限于利用激光的熱能效應來殺滅牙周袋中的致病菌甚至改變菌叢的組成變化來達到治療目的［1］。激光的殺菌作用隨著功率的增大而增強，但對靶器官和鄰近組織、細胞損傷的可能性也隨之增大。低能量激光療法(lowlevel-laser therapy，LLLT)，是通過低能量激光作用于靶組織使其達到調節機能，促進組織功能恢復的作用。臨床應用中低能量激光波長范圍大多在600～950 nm間，且輸出功率只有毫瓦級別，治療過程中不會對生物組織產生不可逆損傷。近幾年的研究表明:LLLT對多種細胞有增殖效應［2-5］。牙周病治療的最終目的是通過刺激牙周膜中的前體細胞分化和再生，促進新附著的形成。人牙周膜細胞(human periodontal ligament cells，hPDLCs)作為一組具有多向分化潛能的細胞，其與牙周組織的修復再生密切相關。因此，本研究通過658 nm低能量激光照射體外培養的人牙周膜細胞，觀察不同能量密度照射對人牙周膜細胞增殖、堿性磷酸酶活性及纖維連接蛋白合成的影響，旨在為低能量激光應用于牙周治療提供理倫依據。

1 材料和方法

1.1 主要器材和試劑

658nm 激光器(Newport，USA)，激光功率計(spectral407a)，L-DMEM培養基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶(GIBCO，USA)，β-甘油磷酸鈉、抗壞血酸、地塞米松(Sigma，USA)，抗人角蛋白抗體廣譜，抗人波形絲蛋白抗體(北京中杉)，噻唑藍 (MTT，Amresco)，二甲基亞砜(DMSO，上海生工)，組織細胞裂解液(北京鼑國生物公司)，BCA蛋白濃度測定試劑盒(北京鼑國生物公司)，堿性磷酸酶試劑盒(南京建成科技有限公司)，人纖維連接蛋白ELISA試劑盒(武漢博士德)。

1.2 方法

1.2.1 hPDLCs的培養及來源鑒定 經患者本人或家長同意，取12-19歲因正畸需要拔除的牙周健康前磨牙，采用改良組織塊法［6］在6孔板中培養 hPDLCs。每3天換液一次。待組織塊周圍細胞生長密集時原孔消化后繼續培養。細胞匯合后傳代培養。免疫細胞化學法對第4代細胞進行波形蛋白抗體、廣譜細胞角蛋白染色，PBS液作為空白對照組。取第3代人牙周膜細胞，以 1×105/mL密度接種至35 mm培養皿中，24 h后棄原培養液，用DMEM礦化誘導液(其中含 10%FBS，10 mmol/L β-甘油磷酸鈉，50μg/mL抗壞血酸，10 mol/L地塞米松)連續培養5周，鏡下見礦化結節形成后，0.1%茜素紅染色，鏡下觀察染色情況。

1.2.2 細胞接種密度的選擇 取第五代對數期生長的hPDLCs，制備十種不同濃度的細胞懸液 (1.0×104個/mL，2.0×104個/mL，至 10 ×104個/mL)，每個細胞濃度對應一個組，共分十組，依次加入96孔板中培養。每孔接種200μL，每組設6個復孔，共接種3塊板。細胞接種后置5%CO2，100%濕度，37℃培養箱培養24 h，48 h，72 h后用MTT法測定細胞的吸光度(OD值)。

1.2.3 激光照射方法及分組 將第5代hPDLCs按2×104個/mL的細胞密度接種于96孔板，共接種9板。每板分空白組，對照組和實驗組，空白組為不含細胞的DMEM培養液，其余兩組接種細胞。每組重復6孔，每孔接種200μL。為阻擋激光散射對鄰近孔內細胞的影響，相鄰孔間添加0.4%無菌臺盼藍染液。每塊采用658 nm激光器進行照射。激光器輸出模式為連續模式，光纖直徑為400μm，光纖末端輸出功率調節為11 mW，光斑面積為0.34 cm2，實驗組照射時間分別為69 s，138 s，對應能量密度分別為1.86 J/cm2和 3.72 J/cm2，對照組不進行激光照射，其余條件同實驗組。激光照射通過96孔板板蓋照射并在暗室中進行，室溫為28℃。

1.2.4 MTT法檢測hPDLCs增殖效應 激光照射24 h，48 h，72 h后，分別取出相應孔板，每孔加5 mg/mL MTT 20μL，繼續培養4 h后終止培養。小心吸棄培養液，每孔加 DMSO150μL，振蕩 10 min，使結晶物充分溶解。在酶標儀490 nm波長處測定各孔細胞吸光度值(OD值)。

1.2.5 激光照射后hPDLCs堿性磷酸酶(ALP)活性測定 分別在激光照射24 h，48 h，72 h后，按照ALP檢測試劑盒及BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測ALP活性及細胞總蛋白量，并計算單位蛋白含量的相對ALP活性。

1.2.6 ELISA法檢測激光照射對hPDLCs中合成纖維連接蛋白 FN的影響 激光照射24 h，48 h，72 h后，按照不同組別收集細胞培養液至干凈EP管中，室溫下，3000 r/min，15 min，收集上清液，按照人纖維連接蛋白試劑盒說明進行測定，用酶標儀在檢測波長450 nm下測定細胞培養液中FN含量。

1.2.7 統計學分析 采用SPSS11.5統計學軟件進行數據分析，所有數據以表示，組間比較用單因素方差分析，兩組間差異用LSD檢驗，檢驗水準α =0.05。

2 結果

2.1 細胞培養和鑒定

4～8天內，hPDLCs可從組織塊周圍游出，鏡下觀察可見細胞排列呈放射狀或漩渦狀，多為長梭形或星形，胞體豐滿，胞漿均勻，核呈圓形或橢圓形(圖1)。細胞波形蛋白染色陽性(圖2)，角蛋白染色陰性(圖3)，證明細胞來源于中胚層。hPDLCs礦化液誘導5周后，鏡下可見顆粒狀的不透明結節形成，呈片狀或層狀，茜素紅染色后呈深紅色(圖4)。

圖1 hPDLCs原代培養 ×100Fig.1 Primary culture of hPDLCs ×100

2.2 hPDLCs接種密度生長曲線

根據hPDLCs不同時間段細胞接種濃度同OD值折線圖(圖 5)，進行線性趨勢分析，24 h，48 h，72 h細胞接種濃度在2.0×104/mL與6.0×104/mL之間同細胞OD值呈線性關系，相關系數分別為0.9762、0.9542、0.9621。由于本實驗觀察周期較長，故選擇最低細胞濃度2.0×104/mL作為合適的接種濃度。

圖2 波形蛋白呈陽性SABC×100Fig.2 Vimentin postive stain of hPDLCs×100

圖3 角蛋白呈陰性SABC×100Fig.3 Keratin negative stain of hPDLCs immunnohistochemical SABC method×100

2.3 658 nm激光照射對hPDLCs增殖效應影響

如表一所示:激光照射24 h后，實驗組同對照組相比，OD值顯著高于對照組(P＜0.01);照射48 h后，實驗組OD值低于對照組，二者比較具有統計學意義(P＜0.01);72 h后，實驗OD值高于對照組，具有顯著差異(0.05);但不同時間點實驗組兩者間無統計學意義(P＞0.05)。

圖4 礦化結節 茜素紅染色 ×100Fig.4 Mineralize nodule of hPDLCs positive Alizarin red staining×100

圖5 hPDLCs增殖率同接種濃度及培養時間三者關系折線圖Fig.5 The line chart of hPDLCs proliferation rate relations with inoculation concentration and incubation time

表1 658 nm激光照射對hPDLCs增殖效應的影響(OD 值，x±s，n=3)Tab.1 Influence of 658 nm laser irradiation on hPDLCs proliferation effect

2.4 658 nm激光照射hPDLCs對ALP活性影響

658 nm 激光照射 hPDLCs 24 h，48 h，72 h 后，檢測細胞培養液中ALP含量以及細胞蛋白含量。根據蛋白標準曲線，得出每孔蛋白含量，計算出單位蛋白含量的相對ALP活性。

如表2所示:在同一培養時間點，激光照射hPDLCss后，細胞分泌ALP含量增高，并且隨激光照射能量密度的增加而升高;但激光照射后隨著培養時間的延長，細胞分泌ALP含量未見明顯變化。

激光照射24 h，48 h，72 h 后，1.86 J/cm2組同相應時間點對照組相比，雖然細胞分泌ALP較對照組高，但二者間無統計學意義;3.72 J/cm2組同相應時間點對照組相比，二者間具有統計學意義，說明3.72 J/cm2能顯著促進 hPDLCss分泌 ALP。激光照射24 h，48 h后，不同劑量照射組間無統計學意義，但72 h后，二者相比有統計學意義。

2.5 658 nm激光照射hPDLCs合成FN影響

如表3所示:激光照射hPDLCs 24 h后，培養液中FN含量未見增高，激光照射48 h和72 h后，照射組培養液中FN含量較對照組增高。但激光照射48 h后，同對照組相比無統計學差異(P＞0.05)，僅在激光照射72 h后，實驗組比對照組細胞上清液中FN含量高(P＜0.05)，但實驗組組間相比無統計學意義(P ＞0.05)。

表2 658 nm激光照射對hPDLCs分泌ALP的影響(OD 值，x± s，n=3)Tab.2 658 nm Laser irradiation effects on ALP hPDLCs secretion

表3 ELISA檢測658 nm激光照射對hPDLCs合成 FN 的影響(OD 值，x±s，n=3)Tab.3 658 nm Laser irradiation effects on hPDLCs synthesis of FN by ELISA

3 討論

MTT法是檢測細胞增殖的常見方法之一。本實驗中96孔板每孔生長面積有限，細胞接種濃度的多少同實驗結果的真實性密切相關。因此，本實驗通過接種不同濃度的細胞，計算細胞接種濃度同OD值間的線性關系，確定合適的細胞接種濃度，以排除細胞接種濃度對實驗結果的影響。除此之外，激光在不同介質中傳播時，能量損耗亦不同。本研究實驗過程中發現:96孔板中培養液存在與否對激光能量損耗不產生影響，但由于溫差緣故，激光照射時96孔板板蓋內表面會形成水霧，水霧的存在影響細胞實際接收的激光能量。因此，每次實驗過程中均通過光功率計對細胞實際接受的激光功率進行測量，保證每次實驗細胞接收的能量相同。

實驗結果表明，激光照射24 h后，照射組細胞增殖速度比對照組顯著加快，說明658 nm激光照射促進hPDLCs增殖，同以往文獻相符［7］。但是，激光照射48 h后，照射組細胞OD值較對照組減低，可能是由于細胞生長過快而產生接觸抑制的緣故。因為在本實驗中細胞接種濃度為 2.0×104cells/mL，較Kreisler M等實驗中細胞接種濃度要高，并且96孔板每孔生長面積有限，激光照射后，hPDLCs快速生長更容易發生接觸抑制。由于hPDLCs可以復層生長，激光照射hPDLCs 96 h后，照射組細胞OD值高于對照組細胞，且照射組同對照組相比具有顯著性差異。本實驗從正反兩方面說明激光能量密度為1.86 J/cm2和 3.72 J/cm2時，658 nm 激光照射能顯著促進hPDLCs增殖，但不同能量密度照射組之間無明顯差異。

堿性磷酸酶是一種分布于細胞膜的鈣結合蛋白，可促進細胞向成骨細胞的分化，其與礦物質的形成改建密切相關，在礦化過程中發揮重要作用。hPDLCs在礦化液誘導后形成礦化結節，說明hPDLCs具有向成骨細胞樣細胞分化的能力。本實驗中，658 nm激光照射hPDLCs后，細胞培養液中ALP活性較對照組增高，提示LLLT具有促進hPDLCs中ALP活性表達，可能促進其向成骨細胞的分化，這同Stein A 等人結果一致［8］。本實驗表明，1.86 J/cm2能量密度能促進hPDLCs分泌ALP，但同對照組相比，兩者無明顯差異，而能量密度為3.72 J/cm2的實驗組同對照組間具有顯著差異。說明hPDLCs只有在接受一定能量密度的激光照射才能促進其分泌ALP。其可能原因是由于激光照射hPDLC作為一種物理刺激，只有在刺激強度達到閾值后才能產生相應的生物效應。其次，Moore P等指出LLLT的生物學刺激效應同激光器的波長有關［9］。

纖維連接蛋白(Fibronectin，FN)作為細胞外基質中粘附糖蛋白，與細胞的生長、遷移、分化過程有關。牙周新附著的形成在于牙周膜細胞較上皮細胞優先占據根面以免上皮結合。本實驗結果表明，能量密度為1.86 J/cm2時，658 nm激光照射能促進hPDLCs分泌FN。Kim等［10］通過動物實驗表明牙齒移動過程中應用低劑量的激光照射能促進牙周組織中纖維連接蛋白和I型膠原蛋白的表達。我們實驗中還發現，658 nm激光照射24 h，48 h后，hPDLCs分泌FN量未見明顯變化，72 h后較對照組明顯增高。可能的原因是激光照射hPDLCs后，細胞合成FN并分泌到培養液中需要一定的時間才能完成。此外，本實驗也發現658 nm激光在能量密度1.86 J/cm2時才能促進細胞FN的合成。其可能原因是由于1.86 J/cm2能量密度的激光照射hPDLCs是一個強度適當的刺激，此時靶組織的生物效應已經達到平臺期，此時接受更大的刺激也不會增強生物效應。

本實驗證實，658 nm低能量激光照射促進hPDLCs增殖、ALP活性及FN合成，可能有助于牙周組織的再生和附著。但不同能量密度的激光照射對hPDLCs產生的生物效應不同。提示LLLT應用于臨床時，需要選定適當的激光參數才能取得理想的療效，有待深入研究。

［1］錢佑，王娟，胡學金.激光治療牙周病的臨床微生物學效應的研究［J］.激光生物學報，1999，18(3):221-227.QIAN You，WANG Juan，HU Xuejin.Bactericidal action of Nd:Yag laser irradiation in periodontal pockets［J］.Acta Laser Biology Sinica，1999，18(3):221-227.

［2］ARISU H D，TURKOZ E，BALA O.Effects of Nd:Yag laser irradiation on osteoblast cell cultures［J］.Lasers Med Sci，2006，21(3):175-180.

［3］CHEN C H，HUANG H S，HSU S H.Low-Energy laser irradiation increases endothelial cell proliferation，migration，and eNOS gene expression possibly via PI3K signal pathway［J］.Lasers in Surgery and Medicine，2008，40(1):46-54.

［4］HOU J F，ZhANG H，YUANX，et al.In vitro effects of low-level laser irradiation for bone marrow mesenchymal stem cells:proliferation，growth factors secretion and myogenic differentiation［J］.Lasers Surg Med，2008，40(10):726-733.

［5］PIRES OLIVEIRA D A，D E OLIVEIRA R F，ZANGARO R A，et al.Evaluation of low-level laser therapy of osteoblastic cells［J］.Photomed Laser Surg，2008，26(4):401-404.

［6］江龍，朱亞琴.改良組織塊法體外培養人牙周膜細胞和牙髓細胞［J］.牙體牙髓牙周病學雜志，2008，18(4):195-199.JIANG Long，ZHU Yaqin.Study on human periodontal ligament cells and dental pulp cells with modified tissue culture in vitro［J］.Chinese Journal of Conservative Dentistry，2008，18(4):195-199.

［7］KREISLER M，CHRISTOFFERS A B，WILLERSTAUSEN B，et al.Effect of low-level GaAIA laser irradiation on the proliferation rate of human periodontal ligament fbroblasts:an in vitro study［J］.J Clin Periodontal，2003，30(4):353-358.

［8］STEIN A，BENAYAHU D，MALTZ L，et al.Low-Level laser irradiatin promotes proliferation and differentiation of human osteoblasts in vitro［J］.Photomedicine and Laser Surgey，2005，23(2):161-166.

［9］MOOREP，RIDGWAY T D，HIGBEE R G，et al.Effect of wavelength on Low-Intensity laser irradiiation-stimulated cell proliferation in vitro［J］.Lasers in Surgery and Medicine，2005，36(1):8-12.

［10］KIM Y D，KIM S S，KIM S J，et al.Low-level laser irradiation facilitates fibronectin and collagen type I turnover during tooth movement in rats［J］.Lasers Med Sci，2010，25(1):25-31.