生物組織光聲粘彈顯微成像＊

陳叢桂，趙 岳，楊思華

(華南師范大學生物光子學研究院激光生命科學研究所、暨激光生命科學教育部重點實驗室，廣東廣州 510631)

0 引言

粘彈性是一個非常重要的物理特征參數，在描述物質在熱力學和動力學的變化過程中都有重要的意義。在醫學上，組織粘彈性的變化往往與病理密切相關［1］。傳統的彈性成像方法僅用彈性這一參數來表征生物組織的力學特性，然而，絕大多數生物組織在力學特性上所表現出的復雜性并不是彈性模量這一項參數就可以完全表述的，在對它們粘彈性表征和流變學行為的描述中，粘滯性往往和彈性一樣重要，尤其是對于軟固體等生物組織，彈性不足以描述其完備的內在特性，如軟骨、骨頭、肌腱和肌肉等，都需要用粘滯性和彈性兩者共同描述來表征特性的變化和醫學的檢測［2］。因此，能夠檢測組織粘彈性特征的檢測技術在醫學應用和臨床研究上具有重要的意義。

光聲成像融合了純光學成像的高對比度和純聲學成像的高分辨率的優點［3-7］，在過去的十年中，光聲成像在血氧飽和度的監測，腦功能成像［8］和易損斑塊的檢測［9］等很多生物醫學應用領域中已經取得了很大的進展［10-13］。目前，常規光聲顯像依靠的是組織光吸收對比度，反映的是組織的光吸收系數，技術上主要是靠測量脈沖或強度調制的激光所激發出光聲信號的幅值來進行組織內部光吸收分布的反演，并沒有考慮到光聲信號產生和傳播過程中的相位信息。實際上，如果以一定頻率的激光作用于組織，根據光聲效應，組織就會形成熱膨脹振動，從而產生與激發光頻率一致的受迫超聲波(即光聲信號)，但由于組織粘彈性產生的阻尼效應，調制激光(相當于應力)和超聲波(相當于應變)之間會產生一定的相位延時［14］。而不同粘彈性質的組織或病理在相同的激發條件下將會產生不同的相位延時。因此，利用測量的相位延時大小作為成像對比度，所重建的圖像則可反映探測點粘彈性質的強弱;比較組織不同探測點的相位延遲，結合一定的圖像信息處理方法，就能重建出反映組織內部粘彈特性分布的粘彈圖像。為了得到更高的分辨率，可以把激光聚焦為點，用點光源來激發組織，產生聲信號，得到組織的光聲粘彈顯微圖像。

課題組在前期研究中基于熱粘彈性理論結合光聲效應波動方程，推導出了軟固體相位延遲和粘彈性之間的關系。本文在此基礎之上，構建出了高對比度高分辨率的光聲粘彈顯微系統，并用模擬樣品驗證了該顯微成像系統的可行性。

1 理論背景

一個強度調制的連續激光照射在吸收各向同性的粘彈組織上，入射光強為［14］:

其中，I0是衍射光強，ω是調制頻率。組織中的吸收體吸收光由于無輻射躍遷導致溫度以如下正弦形式發生變化:

其中，T0是初始溫度，根據熱彈性機制引起組織的熱膨脹和收縮產生光聲信號［15］。由于光強度的周期性變化，光聲波被周期性的激發并且其主頻率等于調制頻率，在上述過程中，局部的循環加熱引起熱應力，由于壓力波形式的應力產生應變。因為生物組織粘彈性的阻尼效應，應變也周期性的交替變化，但是會有一個位相的延遲。考慮到光聲信號的產生過程，我們選擇流變學的

Kelvin-Voigt模型來表示具有粘彈特性的生物組織［16-17］，得到應變響應如下所示［18］:

其中，εA是動態復應變幅值，E是楊氏模量，ω是調制頻率，η是粘度系數。由公式(3)，我們可以知道相位延遲δ和粘彈比η/E的關系:

2 實驗系統與方法

圖1 光聲粘彈顯微成像系統裝置的原理圖Fig.1 Scheme of experimental setup for photoacoustic and viscoelastic microscopy imaging system

實驗原理圖如圖1所示，采用波長為808 nm的連續光半導體激光器作為激發光源，主頻為50 KHz，電光調制器的調制深度為90%，函數發生器產生的調制信號(50 KHz)經放大器放大后用來提供調制器的調制電壓，通過調制器的連續激光被調制為強度變化，由4×顯微物鏡(NA=0.1)聚焦在生物樣品上，樣品制成0.3 mm厚的片，激光通過聚光物鏡在樣品表面的光斑大小約0.1 mm，在樣品表面上的激光功率密度被限制在200 mW/cm2以內，樣品固定在二維電機移動平臺上，超聲換能器(主頻:50 KHz)固定在水槽底部，經樣品后產生的光聲信號由超聲換能器接收，經前置放大器放大后傳至鎖相放大器(SR830，美國斯坦福公司)，鎖相放大器作為相敏檢波器使用，調制信號的另一支作為參考信號輸入到鎖相放大器中，光聲信號和參考信號在鎖相放大器中進行相位比較解得兩路信號的相位延時。在數據采集過程中，樣品被放置在水槽中，并用蒸餾水進行聲耦合。由計算機控制電機的二維掃描并分析光聲信號的相位延遲，得到樣品的二維光聲粘彈顯微圖像。

3 結果

3.1 模擬樣品光聲粘彈成像

理論上，光聲信號和參考信號之間的相位差隨著樣品濃度的增加而減小。為了驗證系統光聲信號的相位延遲與組織粘彈性的關系，分別用濃度為1.2%、2.4%和3.6%的瓊脂樣品模擬具有不同粘彈性能的組織進行光聲粘彈顯微成像，每個樣品測得的相位延遲平均16次。實驗結果如圖2(a)所示，正如理論預期的，光聲信號和參考信號之間的相位差隨著樣品硬度的增加而減小。此外，為了驗證樣品的吸收系數對光聲信號相位延遲的影響，在同一濃度(2.4%)的瓊脂樣品中分別加入2%、4%和6%的黑墨水模擬具有不同吸收系數的組織。理論上，樣品的吸收系數只影響光聲信號的強度，而不影響光聲信號和參考信號之間的相位差。正如圖2(b)結果所示，濃度相同、吸收系數不同的樣品測得的光聲信號與參考信號之間的相位延遲幾乎相同，而光聲信號的強度隨著吸收系數的增大而增大，說明組織的吸收系數可以影響光聲信號的強度，但對光聲信號的相位延遲影響不大。

圖2 (a)不同濃度瓊脂樣品的光聲信號的相位延遲(b)同一濃度不同吸收系數的瓊脂樣品的光聲信號的強度和相位延遲Fig.2 (a)The phase delay obtained by PA measurement from agars with different concentrations.(b)The phase delay and PA intensity of the agar phantoms with same concentrations but different proportions of ink

3.2 系統分辨率測試

為了測試系統的分辨率，實驗用直徑約為60μm左右的頭發絲埋于瓊脂中進行光聲粘彈顯微成像，樣品如圖3(a)所示，其中紅虛線框標注的區域為成像區域，對樣品進行逐點掃描，重建顯微圖像如圖3(b)所示，其中偽彩條表示組織的粘彈比，由圖可知，頭發絲的粘彈比明顯小于周圍瓊脂。圖3(c)為顯微圖像3(b)中虛線位置處的重建剖面圖，由實驗結果，頭發絲半峰寬為57.9μm，說明該系統的成像分辨率至少能達到50μm左右。

圖3 (a)瓊脂中的頭發絲樣品;(b)樣品(a)中紅虛線框內區域的光聲粘彈顯微成像;(c)粘彈顯微圖像(b)中虛線處的光聲信號相位延遲Fig.3 (a)Hair samples in agar;(b)Microscopic images of sample(a)within the red dotted area by photoacoustic viscoelasticity imaging;(c)Phase delay of photoacoustic signal at the dotted line in the microscopic images(b)

3.3 離體組織光聲粘彈顯微成像

為了驗證光聲粘彈顯微系統的成像能力，將一片動物肌肉、一片動物脂肪和一塊動物骨組織等具有不同粘彈性的生物組織置于同一平面內并用瓊脂固定，如圖4(a)所示。對樣品進行逐點掃描，重建粘彈特性分布圖像如4(b)所示，其中偽彩條表示組織的粘彈比。由圖，脂肪相比于肌肉和骨組織具有更高的粘彈比，并且從光聲粘彈顯微圖像中可以清晰地看到不同組織之間的分界，圖4(a)與圖4(b)也符合的很好。結果表明，光聲粘彈顯微成像有較好的對比度和分辨率，可以很好的重建出生物組織粘彈特性分布的顯微圖像。

4 討論和結論

圖4 (a)由肌肉、脂肪和骨組織構成的樣品;(b)樣品的光聲粘彈顯微圖像Fig.4 (a)Sample consists of muscle，fat and bone tissue;(b)Microscopic images of sample(a)by photoacoustic viscoelasticity imaging

該成像系統的精度主要受限于鎖相放大器的時間常數和信噪比，一個較大的時間常數會提高系統性能，但是會降低掃描速度，我們選擇30 ms進行實驗，這也是引起圖4中像素值分布不均勻的主要原因。此外，我們也考慮了在不同組織中聲速不同給相位測量帶來的誤差影響，對于厚度不足0.5 mm的樣品，經過計算和實驗驗證由聲速差異引起的相位差小于0.1 deg，因此，在樣品不厚的情況下，這種影響可以忽略不計。超聲換能器固定于水槽底部，使得系統掃描時光聲信號由換能器單點接收，克服了換能器表面靈敏度不均勻的缺陷，大幅提高了系統的信噪比。若進一步選用高倍聚焦物鏡把入射光斑聚得更小將大大提高系統的成像分辨率，再用更高靈敏度的聚焦換能器來聚焦接收光聲信號，并實現反向接收模式，做成光聲共聚焦反向接收模式的成像系統，這種系統具有更高的信噪比和分辨率，有望實現組織結晶水平的高分辨率成像。

本文提出了一個用光聲粘彈顯微成像表征生物組織粘彈特性的新方法，搭建了一套基于電動平臺掃描的對向接收模式光聲粘彈顯微系統，用于毫米至厘米尺度范圍的生物組織成像。實驗結果表明該成像系統能夠高對比度和高分辨率的重建生物組織的光聲粘彈顯微圖像。這套系統最有潛力應用于動脈粥樣硬化斑塊和早期皮膚腫瘤的診斷檢測，在生物醫學研究和臨床研究中都有很大的應用前景。

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