金雀異黃素對骨髓間充質干細胞誘導分化為神經元樣細胞前后蛋白和Ca2+濃度變化的研究

潘國強 齊鳳平 王相利

骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)，是存在于骨髓中非造血干細胞的另一種具有多分化潛能的干細胞。因具有強大的增殖能力和多向分化潛能，MSCs成為現代生物學和醫學領域研究的熱點。2000年 Woodbury等［1］首次將MSCs在體外誘導分化為外胚層起源的神經元樣細胞。隨后，國內外均有實驗證明了這一點，這為臨床神經系統疾病的細胞治療開啟了一片光明［2］。但對于MSCs誘導分化為神經元樣細胞的確切機制目前還不清楚。金雀異黃素(Genistein)是一種異黃酮類的植物雌激素，在蠶豆中廣泛分布，具有弱雌激素的生物活性，是一種特異性的酪氨酸蛋白激酶抑制劑，Ca2+作為細胞內第二信使參與許多生命活動過程，如細胞代謝、增殖等。為探討使用金雀異黃素阻斷酪氨酸激酶能否對細胞內Ca2+有影響及金雀異黃素對MSCs分化為神經元樣細胞過程中細胞內相關蛋白有無變化，本試驗進一步研究骨髓間充質干細胞誘導分化的機制。報告如下。

1 材料與方法

1．1 材料 培養細胞、免疫組化和激光掃描共聚焦顯微鏡實驗在華北煤炭醫學院中心實驗室完成。實驗用材料:L-DMEM培養基(Sigma)、胎牛血清 FBS(Hyclone)、Percoll分離液(Sigma)、胰蛋白酶(Amersco)、DEPC(Amersco)、Trizol(invitrogen)、SABC免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1．2 方法

1．2．1 骨髓間充質干細胞的分離和培養:取健康成年SD大鼠(雄性，150～200 g，清潔級，由中國藥物檢定所動物中心提供)，無菌條件下取出雙側股骨和脛骨，用含10%FBS的LDMEM，反復沖洗骨髓腔，沖出骨髓后充分混勻，離心后棄上清及脂肪層，沉淀用L-DMEM培養基混勻，輕輕疊加到密度為1．073 g/ml的Percoll分離液上，離心后取乳白色單核細胞層(中間界面層)，再用L-DMEM混勻離心洗滌兩次，細胞沉淀中加入 L-DMEM(含10%FBS)，記數細胞，調整密度，按1×109密度接種于一次性塑料培養瓶中，置于CO2孵箱中培養，48 h后首次換液，棄掉未貼壁細胞。以后每3天換1次液。待培養的細胞增殖接近融合狀態時，用0．25%胰蛋白酶消化細胞，按1∶2比例傳代培養。倒置相差顯微鏡觀察不同時期細胞生長情況。

1．2．2 骨髓間充質干細胞的誘導分化:細胞傳至第5代，待細胞融匯成致密單層后，去除培養液，以0．01 mol/L PBS(pH值7．4)沖洗3 次，加入預誘導液(L-DMEM、1 mmol/Lβ-巰基乙醇、20%FBS)，進行預誘導，24 h后去除預誘導液，0．01 mol/L PBS沖洗3次，加入誘導液(L-DMEM、5 mmol/L β-巰基乙醇)，誘導培養5 h，并在倒置相差顯微鏡下進行觀察、照相。

1．2．3 免疫組化技術檢測:將18 mm×20 mm的蓋玻片放在6孔板中，待細胞融匯成致密單層后，去除培養液，同步化24 h，加入濃度分別為0、25、50、75和 100 μmol/L 的金雀異黃素(誘導前后各10個樣本)，37℃培養箱中培養24 h，吸去培養液，PBS洗2次，按照Woodbury經典誘導方案進行誘導，誘導前后細胞用4%多聚甲醛固定，按SABC法檢測生長相關蛋白-43(Growth Associated Protein，GAP-43)、神經元烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE)、神經絲(neurofilament，NF)和巢蛋白(Nestin)誘導前后的蛋白表達。光鏡下觀察，以細胞漿出現棕黃色顆粒為陽性，未著色為陰性。選擇5～10個高倍鏡視野，采用生物醫學圖像分析系統隨機計數200個細胞，陽性細胞率=(陽性細胞數/200)×100%。

1．2．4 激光掃描共聚焦顯微鏡技術檢測:細胞傳至第四代，細胞消化后傳至共聚焦專用培養皿中(誘導前后各6個樣本)，待細胞融匯成致密單層后，去除培養液，同步化24 h，加入濃度分別為 0、25、50、75 和100 μmol/L 的金雀異黃素，37 ℃ 培養箱中培養24 h，吸去培養液，用含有1 mmol/L的β-巰基乙醇，20%胎牛血清的 L-DMEM進行預誘導，24h后去除預誘導液，0．01 mol/LPBS(pH 值 7．4)沖洗 3 次，加入含有 10 μmol/L Fluo-3/AM的L-DMEM培養液負載45 min，每隔10 min輕輕吹打，避光，45 min 后，0．01 mol PBS(pH 值 7．4)沖洗 3 次，加入誘導液(L-DMEM、5 mmol/L β-巰基乙醇)進行誘導培養，并在激光掃描共聚焦顯微鏡下進行觀測細胞形態和熒光強度的變化。利用分析軟件對數據化圖像進行分析，以參數平均灰度代表細胞內Ca2+濃度變化。

1．3統計學分析應用SPSS 11．5統計軟件，計量資料以±s表示，采用t檢驗，P＜0．05為差異有統計學意義。

2 結果

2．1 MSCs培養、誘導分化 加入預誘導液24 h后MSCs細胞體積縮小，立體感增強，細胞邊緣變得不規整，部分細胞有細的指狀突起，其中約2%的MSCs胞體已變成近似球形，具有短的突起，形狀類似神經元。在加入誘導液后約10 min，觀察到細胞形態開始發生變化，胞體回縮，變得致密有折光性，向外伸出突起。約30 min后，部分細胞向具有神經細胞形態特點的細胞轉化，扁平的胞漿向胞核進一步收縮，細胞體逐漸變成圓形或錐形，折光性增強，胞體周圍具有較強的光暈，胞體伸展的突起繼續延長。以后隨時間進展，1 h、5 h具有神經細胞形態特點的細胞數量逐漸增多，形成雙極或多極細胞，而且細胞的多個突起發出分支，相互交織成網。到5 h后MSCs轉化達到峰值，形態也不再發生明顯改變，具有典型的神經細胞樣形態。

2．2 免疫組化結果 0、25、50、75 和 100 μmol/L 的金雀異黃素培養骨髓間充質干細胞24 h及誘導后，隨著金雀異黃素濃度的增加，GAP-43、NSE、NF和Nestin的陽性細胞率即蛋白水平逐漸增加，25、50、75 和 100 μmol/L 的金雀異黃素 4組與0 μmol/L的金雀異黃素組比較，差異有統計學意義(P＜0．05)。見圖 1、2，表 1。

圖1 0 μmol/L金雀異黃素誘導前MSCs NSE陽性細胞(SP×100)

圖2 0 μmol/L金雀異黃素誘導后MSCsNSE陽性細胞(SP×100)

表1 不同濃度金雀異黃素作用骨髓間充質干細胞前后免疫組化結果

2．3 激光掃描共聚焦顯微鏡觀察結果 MSCs負載熒光探針Fluo-3/AM 45 min后，固定放置在激光掃描共聚焦顯微鏡37℃載物臺上，0．01 mol PBS(pH 值7．4)洗3次，加入誘導液(L-DMEM、5 mmol/L β-巰基乙醇)無血清培養液。從加誘導劑時開始在488 nm激光下掃描觀測細胞形態和熒光強度的變化。利用分析軟件對數據化圖像進行分析，以參數平均灰度代表細胞內Ca2+濃度變化。更換誘導液后，各組細胞內熒光強度逐漸增加，到100 s達高峰值，其后逐漸減弱，但20 min時細胞熒光強度仍高于誘導前，此時可見MSCs開始向神經元樣細胞分化，但是隨著金雀異黃素濃度的增加，［Ca2+］i濃度增加的幅度明顯降低(P ＜0．05)。見圖3～5。

圖3 0 μmol/L金雀異黃素誘導前MSCs細胞熒光圖象(SP×200)

圖4 0μmol/L金雀異黃素誘導后MSCs細胞熒光圖象(SP×200)

圖5 骨髓間充質干細胞誘導分化前后細胞熒光強度的變化

3 討論

骨髓間充質干細胞來源于中胚層，主要存在于全身結締組織和器官間質中，以骨髓組織中含量最為豐富，胎兒臍血中亦可分離得到。MSCs易于貼附于塑料培養板表面，有自我更新和增殖的能力，具有多向和橫向分化的能力，可分化為3個胚層來源的多種組織細胞，如成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、肌細胞和肝卵圓細胞等。MSCs取材方便，易于培養，遺傳背景穩定，自體移植無明顯免疫排斥反應，不涉及倫理道德等問題，并且易于被外源基因轉染并穩定表達，因而被認為是組織工程理想的種子細胞。應用β-巰基乙醇(beta-mercaptoethanol，BME)、二甲基亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO)和4-羥基茴香醚(butylated hydroxyanisole，BHA)等作為誘導劑，在體外成功地誘導成年大鼠和人的MSCs分化為神經元樣細胞和膠質細胞，這為臨床神經系統疾病的細胞治療開啟了一片光明［3，4］。

金雀異黃素(Genistein)是一種異黃酮類植物雌激素，在蠶豆中廣泛分布，具有弱雌激素的生物活性，是一種特異性酪氨酸蛋白激酶抑制劑［5］。在本次試驗中，骨髓間充質干細胞按照Woodbury方案進行誘導成神經元樣細胞后，通過免疫組化證實GAP-43、NSE、NF、Nestin蛋白水平明顯增加，并具有典型的神經細胞樣形態。隨著金雀異黃素濃度增加，誘導后GAP-43、NSE、NF、Nestin蛋白水平亦明顯增加，說明金雀異黃素對骨髓間充質干細胞誘導分化為神經元樣細胞可能有促進作用。

鈣離子幾乎調控機體所有的生理活動，細胞受刺激后，通過細胞信號轉導通路引起細胞內鈣池Ca2+釋放和細胞外Ca2+內流，二者都引起胞漿［Ca2+］i升高，其中細胞外Ca2+內流是引起細胞內［Ca2+］i持續升高的關鍵因素。Ca2+作為細胞內信使發揮作用，其絕對濃度并不是很重要，而其時-空特性在細胞內信號轉導中的作用越來越受到重視［6］。

激光共聚焦掃描顯微鏡(laser scanning confocal microscope，LSCM)是將光學顯微鏡技術、激光掃描技術和計算機圖像處理技術結合在一起的一種高尖設備，這一技術也稱之為“細胞斷層掃描”即細胞CT［7］。Fluo-3/AM是Fluo-3的酯化形式，可透過細胞膜進入細胞，其已酰羥甲基酯(AM)形式無熒光，游離態也無熒光，Fluo-3/AM在細胞內被酯酶水解成Fluo-3，Fluo-3與游離鈣結合后熒光增強50～100倍，為所有鈣熒光探針中變化最大者。Fluo-3產生的熒光強度與細胞內游離鈣離子的濃度成正比，熒光強度的變化可指示游離鈣離子的相應變化。Fluo-3可用488 nm氬激光激發，適用于激光掃描共聚焦顯微鏡。pH值為7．0以上時對其不敏感，對Mg2+也不敏感，故測量結果不宜受這些因素的干擾，故此fluo-3/AM是最佳的用于激光光源的熒光染料。

在本次實驗中，各組骨髓間充質干細胞按照Woodbury經典誘導方案進行誘導，細胞內熒光強度逐漸增加，到100 s達高峰值，其后逐漸減弱，但20 min時細胞熒光強度仍高于誘導前，此時可見MSCs開始向神經元樣細胞分化，但隨著金雀異黃素濃度的增加，Ca2+i濃度各組同時間增加的幅度明顯降低。Ca2+作為細胞內重要第二信使，在Woodbury經典誘導過程中可能不起關鍵性作用。

骨髓間充質干細胞按照Woodbury方案進行誘導分化成神經元樣細胞是否可能導致細胞內一系列反應，啟動MSCs的神經元發育和分化基因表達，以及MSCs的細胞骨架(微絲、微管和中間絲)重排，導致細胞伸出細長突起，部分相鄰的細胞突起連接成網狀，表達神經元特異標志物如GAP-43、NSE、NF、Nestin等，從而MSCs分化為神經元樣細胞，具體機制有待進一步研究。

1 Woodbury D，Schwarz EJ，Prockop DJ，et al．Adult rat and human marrow stromal cells differentiate into neurons．J Neurosci Res，2000，61:364-370．

2 Novikova LN，Brohlin M，Kingham PJ，et al．Neuroprotective and growthpromoting effects of bone marrow stromalcells after cervical spinal cord injury in adult rats．Cytotherapy，2011，13:873-887．

3 Schwarz SC，Schwarz J．Translation of stem cell therapy for neurological diseases．Transl Res，2010，156:155-160．

4 Matsuse D，Kitada M，Kohama M，et al．Human umbilical cord-derived mesenchymal stromal cells differentiate into functional Schwann cells that sustain peripheral nerve regeneration．J Neuropathol Exp Neurol，2010，69:973-985．

5 Ma HP，Ming LG，Ge BF，et al．Icariin is more potent than genistein in promoting osteoblast differentiation and mineralization in vitro．J Cell Biochem，2011，112:916-923．

6 Fischer W，Nrenberg W，Franke H，et al．Increase of intracellular Ca2+by P2Y but not P2X receptors in cultured cortical multipolar neurons of the rat．J Comp Neurol，2009，516:343-359．

7 Arrasmith CL，Dickensheets DL，Mahadevan-Jansen A．MEMS-based handheld confocal microscope for in-vivo skin imaging．Opt Express，2010，18:3805-3819．