全反式維A酸給藥4周對大鼠的毒性作用

陳雁虹，蓋仁華，吳洪海

(浙江大學1.實驗動物中心，2.藥物安全評價研究中心，浙江杭州 310058)

全反式維A酸(all-trans retinoic acid，ATRA)是維生素A的一種代謝衍生物，對細胞增殖、分化和成熟具有調節作用[1]，是維持機體正常生長發育和各種生理活動必不可少的重要物質。由于能夠抑制腫瘤細胞增殖、誘導分化和凋亡，ATRA被廣泛用于治療急性早幼粒細胞白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)[2]，目前臨床已嘗試用于實體瘤的治療[3]。但在臨床應用中發現，ATRA會引起被稱為維A酸綜合征的皮膚干燥、口唇干裂、頭痛、肌肉骨骼疼痛等[4]。骨髓抑制壞死[5]和肝毒性等不良反應，亦有導致高甘油三酯血癥的報道[6]。本研究通過觀察大鼠連續4周ig給予ATRA的長期毒性反應，初步確定其主要毒性靶器官及毒性反應性質和程度，為臨床用藥的安全性提供參考。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑

ATRA由陜西森弗生物技術有限公司提供，批號:20090514，純度99.6%，避光保存于 －20℃，使用前用0.5%羧甲纖維素鈉(CMC-Na)溶液配制成混懸均勻溶液。CMC-Na和EDTA-K2購自國藥集團化學試劑有限公司，批號:30036328。生化試劑盒購自德國羅氏診斷有限公司。凝血試劑盒購自德國西門子醫學診斷產品有限公司。全血細胞計數試劑包購自北京西門子醫療診斷設備有限公司。肝素鈉購自BioSharp公司。甲醛和二甲苯等試劑購自上海申翔化學試劑有限公司。

1.2 儀器

Cobas C311全自動生化儀(德國羅氏公司);CA-550全自動血凝分析儀(日本Sysmex醫用電子有限公司);ADVIA 2120全自動五分類血細胞分析儀(德國Siemens醫療系統集團);5424離心機(德國Eppendorf股份公司);AL104電子天平(上海Metler Toledo儀器有限公司)。EG1150H石蠟包埋機、RM2235組織切片機、ASP300組織脫水機和DM4000電子顯微鏡(德國Leica儀器有限公司)。

1.3 大鼠

SPF級 SD大鼠80只，雌雄各半，體質量160～180 g。由浙江省實驗大鼠中心提供，動物生產許可證號:SCXK(浙)20080033，動物使用許可證號:SYXK(浙)2003-0098，溫度20～24℃，濕度40%～70%，明暗交替12 h/12 h，換氣次數為10～20 h－1，大鼠自由飲水、攝食。

1.4 分組和給藥

SD大鼠80只，按體質量隨機分為4組，分別為溶劑對照組，ATRA 10，50 和 250 mg·kg－1組，每組20只，雌雄各半。大鼠每日上午 ig給予ATRA，給藥容積為 10 ml·kg－1，每天 1 次，連續4周。溶劑對照組給予同等體積0.5%CMC-Na溶液。

1.5 給藥期間對大鼠的觀察

給藥期間每日對大鼠的行為體征、飲食、糞便、呼吸和自發活動等一般狀況進行觀察;每7 d稱量1次體質量和攝食量。

1.6 血液血常規、血液生化和凝血功能檢查

停藥后第1天和第15天，ATRA和溶劑對照組大鼠禁食12 h后，分別取部分大鼠，雌雄各半，10%水合氯醛麻醉后腹主動脈采血，進行血常規、血液生化和凝血功能檢測。

1.7 臟器系數計算和病理組織學的檢查

停藥后第1天和第15天分別進行大鼠尸檢后，取對心、肝、脾、肺和腎等主要臟器進行稱量，計算其臟器系數=臟器質量(g)/體質量(g)×100。各臟器用10%中性甲醛溶液固定，進行常規病理取材、制片和HE染色，顯微鏡下進行病理組織學檢查。

1.8 統計學分析

2 結果

2.1 ATRA對大鼠一般狀況的影響

ATRA 250 mg·kg－1組給藥 14 d 后，大鼠出現毛色黯淡、豎毛、眼瞼部脫毛出血和呼吸急促等癥狀，四肢出現不同程度的骨折現象，自主活動明顯減少;給藥18 d后出現大鼠死亡，至給藥期結束，大鼠有4只死亡，且都為雄性。ATRA 10和50 mg·kg－1組毛色、自主活動和體征反應等均無異常，未出現大鼠死亡。

2.2 ATRA對大鼠體質量和攝食量的影響

如表1和表2所示，ATRA 250 mg·kg－1組給藥1周后體質量逐漸減輕，與溶劑對照組比較有顯著性差異(P＜0.01)，ATRA 10 和 50 mg·kg－1組體質量增長較為緩慢，ATRA 50 mg·kg－1組第2周與溶劑對照組比較有顯著性差異(P＜0.05)，其余組與對照組無顯著性差異。同時與溶劑對照組比較，ATRA 250 mg·kg－1組攝食量逐漸減少(P＜0.05)，ATRA 10 和 250 mg·kg－1組攝食量無明顯變化。

Tab.1 Effect of all-trans retinoic acid(ATRA)on body mass of rats

Tab.2 Effect of ATRA on food intake in rats

2.3 ATRA對血常規指標的影響

如表3所示，停藥后第1天，各組大鼠白細胞計數均較溶劑對照組有升高的趨勢;ATRA 250 mg·kg－1組中性粒細胞、單核細胞和網織紅細胞明顯升高，嗜酸性粒細胞、紅細胞、血紅蛋白濃度、紅細胞壓積和血小板數明顯降低(P＜0.01);ATRA 10和50 mg·kg－1組中性粒細胞明顯升高(P＜0.05);ATRA 50 mg·kg－1組紅細胞、血紅蛋白濃度、紅細胞壓積和血小板數明顯降低，網織紅細胞明顯升高(P＜0.01);ATRA 10 mg·kg－1組紅細胞、血紅蛋白濃度、紅細胞壓積明顯降低(P＜0.01)，網織紅細胞明顯升高(P＜0.05)。其中，ATRA對紅細胞、血紅蛋白濃度、紅細胞壓積、血小板、網織紅細胞的影響存在一定的劑量依賴性。停藥后第15天，ATRA各組大鼠中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、紅細胞壓積和血小板有不同程度的恢復，而較溶劑對照組，ATRA 250 mg·kg－1組白細胞、淋巴細胞、紅細胞、血紅蛋白濃度仍有明顯的降低，網織紅細胞有明顯的升高(P＜0.01);ATRA 50 mg·kg－1組白細胞、淋巴細胞有明顯的降低，網織紅細胞有明顯的升高(P＜0.01);ATRA 10 mg·kg－1組白細胞、淋巴細胞和血紅蛋白濃度明顯降低(P＜0.01)。

2.4 ATRA對血生化指標的影響

如表4所示，停藥后第1天，與溶劑對照組比較，ATRA 250 mg·kg－1組總蛋白、白蛋白、總膽紅素和肌酐明顯下降，球蛋白、丙氨酸轉氨酶、天冬氨酸轉氨酶和甘油三酯明顯上升(P＜0.01)，同時葡萄糖明顯升高，肌酸激酶明顯降低(P＜0.05)。ATRA 50 mg·kg－1組白蛋白和肌酸激酶明顯降低，球蛋白、天冬氨酸轉氨酶和甘油三酯明顯上升(P＜0.01)，總蛋白和總膽紅素明顯降低(P＜0.05)。ATRA 10 mg·kg－1組白蛋白明顯降低，天冬氨酸轉氨酶、葡萄糖和甘油三酯明顯上升(P＜0.01)，總蛋白和肌酐降低(P＜0.05)，血清總膽固醇有升高(P＜0.05)。其中，ATRA對總蛋白、白蛋白、球蛋白、丙氨酸轉氨酶、總膽紅素、天冬氨酸轉氨酶、肌酐和甘油三酯的影響存在一定的劑量依賴性。其他生化指標包括電解質指標與溶劑對照組比較無顯著性差異。停藥后第15天，與溶劑對照組比較，ATRA 250 mg·kg－1組天冬氨酸轉氨酶明顯上升，肌酐和葡萄糖明顯降低(P＜0.01)，但均較停藥后第1天有所恢復;與溶劑對照組相比，ATRA 10和50 mg·kg－1組血清總膽固醇明顯降低(P＜0.01，P＜0.05)。其余各項指標均有不同程度的恢復，與溶劑對照組比較無顯著性差異。

Tab.3 Effect of ATRA on blood routine in rats on 1st and 15th day after drug withdrawal

Tab.4 Effect of ATRA on parameters of blood biochemistry in rats on 1st and 15th day after drug withdrawal

2.5 ATRA對凝血指標的影響

如表5所示，停藥后第1天，ATRA 250 mg·kg－1組血漿凝血酶原時間(prothrombin time，PT)和國際標準化比值(international normalized ratio，INR)明顯延長，凝血酶時間(thrombin time，TT)明顯減少(P＜0.05)。ATRA 50 mg·kg－1組 PT，INR 和活化部分凝血酶時間(activated partial thromboplastin time，APTT)明顯延長(P＜0.01)，TT 明顯減少(P＜0.05)。ATRA 10 mg·kg－1組 PT，INR 和APTT明顯延長(P＜0.01)。停藥后第15天，ATRA 10，50和250 mg·kg－1組PT，TT，INR和APTT 等凝血指標與溶劑對照組比較均無顯著性差異。

2.6 ATRA對臟器系數的影響

如表6所示，停藥后第1天，與溶劑對照組比較，ATRA 250 mg·kg－1組心、肝、脾、肺、腎和腎上腺的臟器系數明顯升高(P＜0.01)，胸腺臟器系數明顯降低(P＜0.01)。ATRA 50 mg·kg－1組肝和脾的臟器系數明顯升高(P＜0.05，P＜0.01)。與溶劑對照組比較，ATRA 10 mg·kg－1組肝臟器系數明顯升高(P＜0.01)。停藥后第 15天，ATRA 250 mg·kg－1組心、肝、脾、肺、腎和腎上腺的臟器系數仍較溶劑對照組明顯升高(P＜0.01)，ATRA 10和50 mg·kg－1各臟器系數均有所恢復，與溶劑對照組無明顯差異。

Tab.5 Effect of ATRA on parameters of blood coagulation of rats on 1st and 15th day after drug withdrawal

Tab.6 Effect of ATRA on organ index on 1st and 15th day after drug withdrawal

2.7 ATRA對臟器病理組織學的影響

停藥后第1天，顯微鏡觀察發現，ATRA 50和250 mg·kg－1組大鼠出現肝髓外造血(圖 1C，D);ATRA 250 mg·kg－1組出現肝細胞水腫(圖 1D);ATRA 250 mg·kg－1組出現十二指腸上皮細胞變性、壞死(圖2D);ATRA 10，50 和250 mg·kg－1組均出現脾巨核細胞增多(圖3B～D);ATRA 250 mg·kg－1組胸腺皮質細胞減少(圖 4D);生殖系統組織病理改變主要表現為ATRA 50和250 mg·kg－1組大鼠睪丸曲精細管萎縮和生精細胞減少(圖 5C，D)，ATRA 250 mg·kg－1組附睪管腔內精子減少并伴有間質水腫(圖6D)。此外還發現骨骼出現纖維組織增生，類骨組織和骨小梁增生現象，部分大鼠毛囊減少。停藥后第15天，ATRA 10，50和250 mg·kg－1組仍存在脾巨核細胞增多，ATRA 250 mg·kg－1組5/8只大鼠睪丸出現中度曲精細管萎縮、生精細胞減少，2/8只大鼠出現毛囊減少，其他臟器整體病理改變較給藥期有所恢復(圖略)。

Fig.1 Effect of ATRA on liver histopathological changes in rats(HE).See Tab.1 for rat treatment.The rats were sacrificed on the 1st day after drug withdrawal.The yellow arrow refers to liver cells steatosis while the green arrow refers to liver cells edema and the blue arrow refers to extramedullary hematopoiesis.A:solvent control;B －D:ATRA 10，50 and 250 mg·kg－1，respectively.

Fig.2 Effect of ATRA on duodenum histopathological changes in rats(HE).See Fig.1 for rat treatment.The yellow arrow refers to duodenal epithelium cells degeneration and necrosis.A:solvent control，B －D:ATRA 10，50 and 250 mg·kg －1，respectively.

Fig.3 Effect of ATRA on spleen histopathological changes in rats(HE).See Fig.1 for rat treatment.The yellow arrow refers to megakaryocytes.A:solvent control，B －D:ATRA 10，50 and 250 mg·kg－1，respectively.

Fig.4 Effect of ATRA on thymus histopathological changes in rats(HE).See Fig.1 for rat treatment.The yellow arrow refers to thymus cortical cells reduced.A:solvent control，B －D:ATRA 10，50 and 150 mg·kg－1，respectively.

Fig.5 Effect of ATRA on testis histopathological changes in rats(HE).See Fig.1 for rat treatment.The yellow arrow refers to seminiferous tubular atrophy and spermatogenic cells decreased.A:solvent control;B －D:ATRA 10，50 and 250 mg·kg－1，respectively.

Fig.6 Effect of ATRA on epididymis histopathological changes in rats(HE).See Fig.1 for rat treatment.The yellow arrow refers to the reduction of sperm within the epididymis lumen while the blue arrow refers to interstitial edema.A:solvent control;B－D:ATRA 10，50 and 250 mg·kg－1group，respectively.

3 討論

本研究結果顯示，口服ATRA大鼠的紅細胞數、血小板數和血紅蛋白含量明顯低于正常值，并有劑量依賴性毒性反應關系，說明ATRA能造成大鼠不同程度的血小板減少癥和貧血癥，同時存在一定的粒系增生和骨髓抑制現象。病理結果顯示大鼠肝和生殖系統有損傷。睪丸曲精細管萎縮、生精細胞減少提示ATRA可能對雄性生殖系統有一定的毒性作用。

本研究發現，ATRA誘導分化的ALP細胞分泌白細胞介素1β(IL-1β)，IL-6，IL-8和腫瘤壞死因子α等血管活性細胞因子，進而促進白細胞活化[6]。同時ATRA能夠抑制體內IL-2基因表達和T細胞活性[7]。這些細胞因子的變化可能是發生維A酸綜合征的原因。

ATRA 250 mg·kg－1組大鼠出現呼吸急促可能與APL-ATRA細胞浸潤大鼠肺組織有關。周晉等[8]用微重力旋轉培養法體外模擬維A酸綜合征，發現APLATRA細胞浸潤人肺組織的分子機制可能與CXCR4和SDF-1α的高表達有關。徐娟等[9]對APL患者的細胞黏附分子表達進行動態監測，發現CD11b的大量表達與維A酸綜合征有密切關系。CD11b的表達速度過于同步化，使得大量表達黏附分子白血病細胞滯留與肺循環，導致嚴重的通氣功能障礙。

本研究病理結果顯示，給藥組大鼠出現髓外造血和脾巨核細胞增多，可能是由于紅細胞數和血小板數下降機體的代償反應，同時ATRA能夠抑制巨核細胞，造成巨核細胞成熟障礙而不能正常制造血小板，引起血小板減少。ATRA組總蛋白偏低，兩種轉氨酶、堿性磷酸酶、葡萄糖與甘油三酯偏高，同時出現肝細胞水腫，說明ATRA能導致大鼠肝功能受損，并可能導致血糖升高和高甘油三酯血癥。亦有ATRA臨床致高甘油三酯血癥的報道[10]。病理研究結果顯示，纖維組織增生、類骨組織和骨小梁增生現象與骨折的判斷吻合。ATRA為公認的致畸物，可以導致大小鼠、倉鼠和兔等多種實驗動物胚胎畸形，機制與ATRA抑制Smad2和Smad3的磷酸化有關[11－13]。以上毒性作用與臨床所見個別患者的不良反應存在一致性，可為臨床用藥不良反應監測提供參考。更多的毒理機制有待進一步研究。

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