β－氯氰菊酯對斑馬魚胚胎的發育毒性

徐永學，劉麗麗，王 健，閆艷春

(中國農業科學院研究生院生物學教研室，北京 100081)

擬除蟲菊酯類(pyretbroids)農藥是由國外公司于20世紀70年代開發的一類新型高效仿生殺蟲劑，被譽為殺蟲劑歷史上的第三個里程碑;因其具有高效、安全、殺蟲譜廣、低殘留等特點，被廣泛用于農業生產。近年來，擬除蟲菊酯類殺蟲劑發展十分迅速，產量已占據全世界殺蟲劑市場的30%[1]，并被我國列入替代高毒農藥的理想品種。

一種高效氯氰菊酯β－高效氯氰菊酯(乙體氯氰菊酯，beta－cypermethrin)屬Ⅱ型擬除蟲菊酯類成農藥，化學名為(R，S)－α－氰基－3－苯氧基芐基(1R，3R)－3－(2，2－二氯乙烯基)－2，2－二甲基環丙羧酸酯，化學式為C22H19Cl2NO3，結構式見圖 1[2]，是氯氰菊酯經差向異構得到的兩對活性較高的對映體[3]。因其生產工藝簡單、生產成本低和藥效更高以及對哺乳類動物毒性小等優點，在我國已占據了擬除蟲菊酯類農藥市場份額的50%以上[4]。但由于β－氯氰菊酯對魚類具有高毒性，在許多國家其用量受到嚴格控制，如歐盟等國家都制定了最大殘留量標準。

Fig.1 Chemical structure of beta－cypermethrin.

斑馬魚是一種小型熱帶淡水魚，基因與人類基因的相似度達到87%，發育過程、器官構造、生理功能、基因結構等都與哺乳類動物非常相近。作為一種新的模式脊椎動物已被廣泛用于毒理學的研究中，經濟合作與發展組織在1996年將斑馬魚胚胎發育方法列入測定單一化學毒性的標準方法之一，并制定了詳細的操作指南。斑馬魚胚胎應用于毒理學研究有諸多優點:體外受精，體外發育而且具有光學透明性，光學顯微鏡可穿透其組織，觀察者可清楚地看到各個發育階段，毒理測試時可方便評價毒理學終點;發育迅速，測試周期短，一般不超過1周即可完成;成魚繁殖能力強，一條雌魚一般每次可產卵100～300枚，每周可產卵1次，樣本數可以很大，以確保統計學意義上的顯著性;成魚體型小，易于飼養管理，成本低。此外，最大優勢在于有豐富的毒性反應指標(致死、亞致死、致畸)可供觀察和分析[5]，因此正逐步替代傳統成魚用于急性毒性實驗等[6]。

本研究以斑馬魚胚胎為模型，觀察β－氯氰菊酯暴露所導致的斑馬魚胚胎發育毒性，補充此類農藥對胚胎發育毒性數據的短缺，為制定更加完善的環境評價標準及風險管理提供毒理學依據。

1 材料與方法

1.1 藥物和儀器

β－氯氰菊酯，純度＞99%，由中國廣東立威化工有限公司提供;丙酮，分析純，中國北京化工廠;一次性培養皿和巴斯特吸管，中國江蘇省海門市昊遠實驗儀器廠;LRH－250生化培養箱，中國上海一恒科技儀器有限公司;CKX41倒置顯微鏡，日本奧林巴斯公司;XMTD－6000電熱恒溫水浴鍋，中國北京六一儀器廠;TH－300梯度混合器，中國上海滬西分析儀器廠有限公司;JPBJ－608型便攜式溶解氧分析儀和PHS－3D雷磁pH計，中國上海精密科技儀器有限公司。

1.2 胚胎培養液

胚胎培養液即 Holt緩沖液，配方如下(g):NaCl 3.5，KCl 0.05，NaHCO30.025，CaCl20.1，用去離子水補至1 L。

1.3 斑馬魚的飼養

實驗用魚為AB品系斑馬魚，親本斑馬魚由北京大學生命科學學院遺傳學與發育生物學研究中心贈送。后經本實驗室繁殖擴大飼養，至6月齡性成熟能夠穩定產卵，體長4.0～5.0 cm，自然死亡率＜0.5%。

飼養方案按照文獻[7]進行，依據文獻[8]對發育階段分期。雌雄魚分開飼養，光周期嚴格控制光照/黑暗14 h∶10 h，水溫控制在 27.5～28.5℃，電導率為460～500 μS·cm－1，pH 6.75～7.25，溶氧＞6.0 mg·L－1。每天早、中、晚定時投喂 3 次新鮮孵化的豐年蟲無節幼體，并及時清理殘食廢物，每周檢測水質以保證各參數穩定。

1.4 斑馬魚的交配與收卵

在交配產卵的前一天晚上，選擇體型健壯、游動靈活的健康成年斑馬魚于專用交配盒內，親魚雌雄分開且比例為1∶1或1∶2，為保證水溫維持在28.5℃，將配魚缸置于水浴鍋內。第二天早晨給予光照，抽隔板后30 min內完成交配產卵。根據Schulte和Nagel[6]的方法收集魚卵。用巴斯特吸管將魚卵收集于一次性培養皿中，用新鮮的養魚水清洗數次以除去未受精卵、糞便等殘留物，然后轉移至光照生化培養箱，溫度28.5℃，發育至受精后3 h(3 hours post－fertilization，3 hpf)左右在倒置顯微鏡下挑選出正常分裂的魚卵，進行毒性實驗。

1.5 β－氯氰菊酯的毒性觀察

由于β－氯氰菊酯在空氣、陽光下及在中性及微酸性介質中相對比較穩定，不易揮發，不易發生水解、光解等反應，所以采用換水式對斑馬魚胚胎進行毒性實驗。為了排除未受精卵及先天發育異常的受精卵對毒性評價的干擾，確保對照組異常卵的發生率小于3%，選擇在3 hpf時(囊胚期)開始染毒。選用一次性培養皿進行實驗，每個培養皿做一個濃度，放入30枚魚卵和40 ml溶液，β－氯氰菊酯0.05，0.1，0.15，0.2，0.6，1 mg·L－1，以及空白對照和助溶劑對照。為保證每個β－氯氰菊酯溶液濃度的準確性，開始染毒前先將魚卵小心的轉移到培養皿中，盡量去除水分之后再分別加入不同濃度的受試物溶液和對照液。然后將各培養皿迅速轉移到生化培養箱中，溫度恒定在28.5℃。顯微鏡下進行觀察直至96 hpf，期間及時清除死亡的胚胎，并記錄現象。

用丙酮作溶劑配制 β－氯氰菊酯 0.1 kg·L－1儲液，然后用培養液Holt緩沖液稀釋配成不同濃度的β－氯氰菊酯溶液，丙酮濃度不超過1%。β－氯氰菊酯溶液在實驗當天臨時配用，實驗過程中每12 h更換一半受試物溶液，以保證溶液中各參數的穩定。

1.6 統計學分析

2 結果

2.1 β－氯氰菊酯對斑馬魚形態學的影響

與正常對照組比較，丙酮對照組斑馬魚胚胎在整個觀察期(96 hpf)內發育進程非常同步且未觀察到任何毒性反應，而 β－氯氰菊酯 0.05，0.1，0.15，0.2，0.6 和1 mg·L－1組胚胎在24 hpf以前形態上未觀察到明顯異常，從48 hpf以后表現出不同程度的毒性反應癥狀，如體軸彎曲、心包囊腫等(圖2D2－E3);β－氯氰菊酯0.2，0.6 和1 mg·L－1組的部分胚胎在48 hpf即有明顯體軸彎曲畸形反應(圖2D2)，β－氯氰菊酯0.05，0.1 和0.15 mg·L－1組在72 hpf才逐漸出現(圖2C3);而心包囊腫在48 hpf時未觀察到，至 72 hpf時除 β－氯氰菊酯0.05 mg·L－1組外都開始大量出現(圖2D3);并且在72 hpf以后β－氯氰菊酯組胚胎全部沉于容器底部呈抽搐狀態失去游動能力，而正常對照組胚胎孵化脫膜后呈懸狀貼在容器壁上，在72 hpf時已能夠自由游動。此外，與正常對照組相比，β－氯氰菊酯0.2，0.6 和1 mg·L－1組幼魚在72 hpf時胸鰭發育受到嚴重抑制且黑色素減少體色偏黃(圖2E3)。

Fig.2 Effect of beta－cypermethrin on morphological development of zebrafish embryos at 24 hpf，48 hpf and 72 hpf.A:normal control;B:acetone control;C，D and E:beta－cypermethrin 0.1，0.2 and 1 mg·L －1groups，respectively.1 －3:24，48 and 72 hpf，respectively.Arrows indicate pericardial edema in response to beta－cypermethrin stress.

2.2 β－氯氰菊酯對斑馬魚24 hpf自主抽動的影響

斑馬魚胚胎發育至24 hpf時尾部表現出強烈的抽動。圖3結果顯示，正常對照組胚胎為(0.72±0.19)min－1，β－氯氰菊酯1 mg·L－1組胚胎為(3.83±1.07)min－1。此外，與正常對照組相比，β－氯氰菊酯0.05，0.1 和0.15 mg·L－1組平均胚胎抽動次數無太大變化但波動程度明顯增強，而β－氯氰菊酯0.2，0.6 和1 mg·L－1組胚胎抽動次數及劇烈程度隨著β－氯氰菊酯組濃度的升高都顯著增強，且類似抽搐狀。

2.3 β－氯氰菊酯對斑馬魚48 hpf孵化率的影響

斑馬魚胚胎從48 hpf開始脫膜孵化，是胚胎發育過程的一個重要時期，常被用于毒性評價的重要毒理學終點，諸多文獻報道了孵化率與毒性之間的關系[9]。本實驗中，發現正常對照組胚胎48 hpf孵化率約為(15.5±1.2)%，β－氯氰菊酯 1 mg·L－1組為(98.9±4.3%)%。即β－氯氰菊酯加快了斑馬魚胚胎的孵化，且 β－氯氰菊酯 0.15，0.2，0.6和1 mg·L－1組的胚胎48 hpf時幾乎全部孵化完成，而β－氯氰菊酯0.05，0.1 和0.15 mg·L－1組胚胎的孵化率呈現清晰的劑量依賴關系，即在一定濃度范圍內，β－氯氰菊酯濃度與孵化率呈正相關性趨勢(r=0.92，P＜0.05)(圖4)。

Fig.3 Effect of beta－cypermethrin on counts of spontaneous movements of zebrafish embryos at 24 hpf.C1:normal control;C2:acetone control.±s，n=3.*P＜0.05，compared with normal control group.

Fig.4 Effect of beta－cypermethrin on percentage of hatching in zebrafish embryos at 48hpf.C1:normal control;C2:acetone control.±s，n=3.*P＜0.05，compared with normal control group.

2.4 β－氯氰菊酯對斑馬魚48 hpf心率的影響

心率是斑馬魚胚胎毒性測試實驗中一個非常重要的亞致死毒理學終點。正常對照組48 hpf胚胎10 s心臟跳動約30.0次，β－氯氰菊酯組胚胎心率加快達到34.7次，且各β－氯氰菊酯組數值相近，但是72 hpf以后，隨著心包囊腫的發生，有些個體心跳明顯減弱，血液循環減慢，出現了嚴重異常。正常對照組胚胎心率與Kimmel等[8]報道的非常一致。

2.5 β－氯氰菊酯對斑馬魚體軸彎曲的影響

圖5 結果顯示;β－氯氰菊酯 0.05 mg·L－1組在72 hpf和96 hpf畸形率分別是 6.6%和 10%，β－氯氰菊酯1 mg·L－1組分別是97.8%和 100%;同一濃度β－氯氰菊酯，96 hpf胚胎畸形率明顯高于72 hpf的畸形率;不同濃度β－氯氰菊酯組之間比較，濃度越高畸形率越高，呈現一定的時間劑量依賴性(r=0.87，P＜0.05)。β－氯氰菊酯 0.6 和1 mg·L－1組胚胎在72 hpf時幾乎全部畸形且部分個體出現嚴重的心包囊腫;發育至96 hpf時畸形加劇。

Fig.5 Effect of beta－cypermethrin on cumulative spine malformation rate in zebrafish embryos at 72 hpf and 96 hpf.C1:normal control;C2:acetone control.±s，n=3.*P＜0.05，compared with normal control group.

3 討論

本實驗以丙酮作助溶劑，為避免助溶劑丙酮的毒害作用影響，控制β－氯氰菊酯溶液中丙酮濃度不能超過1%，經過多次預實驗和觀察，最終確立了β－氯氰菊酯濃度:0.05，0.1，0.15，0.2，0.6 和1 mg·L－1。在此濃度范圍內 β－氯氰菊酯能夠完全溶解，但是未能引起斑馬魚胚胎致死，因此，本研究未探討β－氯氰菊酯對斑馬魚胚胎的劑量－致死效應關系，而主要對亞致死、致畸毒理學終點進行了觀察探討。

對于毒理學終點的觀察，為方便定量與清晰的原則，主要選擇了在5個重要且清晰的發育時間點(8，24，48，72和 96 hpf)進行仔細觀察，包括24 hpf自主抽動、48hpf孵化率及心率、72和96 hpf色素沉積、體軸彎曲及心包囊腫等，并重點記錄了24 hpf自主抽動次數、48 hpf孵化率以及72和96 hpf體軸彎曲個體比例。胚胎發育正常與否的判斷主要參考Kimmel等的描述。

Kimmel等發現，斑馬魚自主抽動是由于肌肉系統和運動神經元系統接點發育引起，不受機體控制的活動，是運動神經系統未發育完全的表現。早在2002年，Drapeau等[11]對斑馬魚運動神經網絡進行了深入研究，發現這種活動最早起始于14體節時期，至20體節時期達到高峰，隨后隨著神經系統的完善而逐漸減弱。本實驗中，正常對照組斑馬魚胚胎在24 hpf時自主抽動次數平均每分鐘不到1次，表明神經系統已發育到相對完善的時期，而β－氯氰菊酯組胚胎活動遠強于正常和溶劑對照組，表明神經系統的發育受到抑制，β－氯氰菊酯對斑馬魚胚胎具有很強的神經毒性。

孵化過程是生化與機械力共同作用的結果。生化作用主要依賴孵化酶即Zn－金屬蛋白酶對卵膜的降解作用;經酶作用后，胚胎尾部的抽動將卵膜撕破完成孵化過程。因此，對孵化酶或運動能力的毒害作用都會影響斑馬魚胚胎的順利孵化。據報道能夠抑制蛋白酶活性的金屬離子如鎘和銅等會降低孵化酶的活性，從而導致胚胎孵化延遲[12]。本實驗發現，在一定濃度范圍內，β－氯氰菊酯加速了胚胎的孵化。綜合本實驗觀察結果推測β－氯氰菊酯可能未導致孵化酶活性降低，而自主抽動程度的加劇促進了卵膜的破裂，進而加速了孵化過程。對于β－氯氰菊酯與孵化酶的詳細作用機制本實驗未做探究，有待進一步驗證。

斑馬魚心血管在20 hpf開始形成，能夠收縮但尚未與發育中的血液循環系統相連，發育至30 hpf時心臟分化出心室和心房，36 hpf時開始規律的心跳[13]。正常生長條件下，48 hpf時主要的器官系統完成形態發生并開始破膜孵化，此時心臟功能已相對比較完善，是斑馬魚胚胎發育進程的一個重要轉折點。心率容易受外界因素如溫度、用藥等的影響而加快，但通常會隨著外界因素的消除而逐漸恢復正常。本實驗中，除用藥外其他實驗條件完全相同，故斑馬魚胚胎心率的加快必然是由于β－氯氰菊酯暴露所致。有趣的是，β－氯氰菊酯組胚胎心率加快至每10 s 34.7次，且各濃度組數值相近，并未隨著β－氯氰菊酯濃度的增大而明顯增加，實際上這一心率數值很可能已接近斑馬魚胚胎心率的最大值，很難再有明顯的增加。這也在某種程度上表明，在48 hpf之前斑馬魚胚胎可能由于受到卵膜的保護并未因為暴露于β－氯氰菊酯導致嚴重的心臟功能衰竭，而是通過增加心率加快全身血液的供應，以滿足氧氣、營養物質等的需要。但是在72 hpf后，β－氯氰菊酯組胚胎出現了不同嚴重程度的心包囊腫，故綜合本實驗結果，推斷β－氯氰菊酯暴露至48 hpf時，很可能已經導致斑馬魚胚胎心功能不全但未嚴重衰竭，而在隨后發育過程中加劇并引起諸多胚胎出現嚴重的心包囊腫，心跳微弱和血液循環減慢。

體軸彎曲等畸形是斑馬魚胚胎毒性檢測實驗中常出現的毒性反應。已有研究表明，四溴聯苯醚[14]、四氯二苯并－p－二噁英[15]和銅[16]等都會引起斑馬魚胚胎發育畸形。體軸的彎曲通常是由于體軸肌肉組織損壞，包括肌肉細胞壞死及肌纖維受損，或脊椎骨原件自身發生畸形所致;此外，鈣離子通道功能紊亂也會導致脊柱彎曲[17]。本實驗中斑馬魚幼魚體軸彎曲，可能是由于β－氯氰菊酯暴露導致肌肉組織損傷和神經肌肉系統發育受損兩方面原因所致，具體機制還需進一步驗證。

與其他脊椎動物相似，斑馬魚黑色素細胞由神經嵴發展而來[18]。斑馬魚胚胎發育至24 hpf黑色素開始出現[8]。本實驗發現，72 hpf處理組幼魚黑色素減少體色偏黃，很可能是由于早期神經發育受到抑制所致。

影響擬除蟲菊酯類對魚類毒性作用的因素很多。如魚的年齡，一般認為斑馬魚胚胎較成魚相比對外源毒物更為敏感。環境因素如溫度也會影響擬除蟲菊酯類對動物毒害作用，Weston等[19]發現擬除蟲菊酯類對魚類的毒性作用與溫度成反向相關的關系。此外，所含異構體比例不同表現出的毒性作用差別也很大[20]。β－氯氰菊酯作為擬除蟲菊酯類農藥的一種，具有很強的疏水性，容易被魚鰓吸附;另外，由于魚體內缺乏水解擬除蟲菊酯類的酶，擬除蟲菊酯類在魚體內的代謝主要靠氧化作用，致使擬除蟲菊酯類對魚類的毒性作用遠大于對哺乳動物和鳥類的毒性作用[21]。在96 h觀察期內，斑馬魚胚胎孵化完成之前并未出現卵凝結、尾部不延展、無體節和無心跳等致死毒理學終點，只觀察到心跳加速，自主抽動強烈;而孵化完成之后逐漸出現了體軸彎曲、心包囊腫和體長較短(未作數據統計)等嚴重的畸形效應，甚至96 hpf時有些幼魚只有微弱的心跳而身體已經完全不能動，表現出孵化完成后毒性更強的特征。推測很可能是由于β－氯氰菊酯具有很強的親脂性，與斑馬魚胚胎卵膜結合，使其不易進入胚胎體內，而孵化后胚胎由于失去了卵膜的保護對化學物質更為敏感。曾有文獻認為去卵膜之后能夠改善胚胎毒性測試[22]。

動物實驗研究表明，擬除蟲菊酯類農藥對處于發育時期的動物表現出更強的毒性[23]。并且已有報道稱孕婦、兒童甚至嬰幼兒尿液中含有擬除蟲菊酯類農藥代謝產物[24]。DeMicco 等[25]通過6 種常見擬除蟲菊酯類對斑馬魚胚胎的神經發育毒性，發現擬除蟲菊酯類對斑馬魚和哺乳動物引起的神經毒性非常相似且具有很強的神經毒性;而且其自主抽動隨著濃度的增加而加劇與本實驗的觀察一致。Shi等[26]在氯氰菊酯對斑馬魚胚胎幼魚的毒性研究中采用吖啶橙染色法發現神經系統呈現大量細胞凋亡，并出現體軸彎曲、心包囊腫等毒性反應;Xu等[20]對β－氯氰菊酯4種對映異構體的斑馬魚胚胎致畸毒性分別進行了研究，也有心包囊腫和體軸彎曲等畸形出現，但是未對神經毒性進行探討。

歐盟等國家規定在谷物、水果和蔬菜中β－氯氰菊酯最大殘留量為0.02 mg·L－1;在西紅柿、豆莢蔬菜和玉米谷物中最大殘留量為0.05 mg·L－1;在黃瓜中最大殘留量為0.1 mg·L－1;在杏、萵苣和桃中最大殘留量為0.5 mg·L－1，而在我國目前尚未制定β－氯氰菊酯殘留限量。本實驗中，β－氯氰菊酯0.05 mg·L－1對斑馬魚胚胎暴露20 h既能對神經系統產生嚴重的損害，暴露至72 hpf時引起體軸彎曲，而 β－氯氰菊酯 0.05 mg·L－1遠低于歐盟國家制定的在杏、萵苣和桃中最大殘留量0.5 mg·L－1，因此，這一數值可以為制定其在某些食物尤其是水產品中的殘留限量提供重要的參考，且應當低于0.05 mg·L－1，確切的安全限量還需大量實驗進行驗證。此外，孕婦、兒童及嬰幼兒應遠離暴露有高效氯氰菊酯的環境，杜絕含有其高殘留的食品，避免危害的發生。近期國內有學者發現，某地區95%被檢孕婦尿中檢測出擬除蟲菊酯類代謝產物，且暴露水平高于國外相關數據，高暴露組幼兒的發育商顯著低于低暴露組幼兒[27]。

綜合本實驗結果，β－氯氰菊酯對斑馬魚胚胎具有嚴重的神經毒性，對孵化完成后的幼魚心臟和體軸等表現出嚴重的致畸效應并呈現明顯的時間劑量依賴性，高濃度下還會嚴重抑制胚胎發育進程，為深入研究β－氯氰菊酯對斑馬魚胚胎的發育毒性提供了證據和線索。

致謝:感謝北京大學生命科學學院張博教授提供實驗材料及斑馬魚飼養技術指導;感謝劉麗麗、王健、史延華和宋金龍在實驗和本文寫作中給予的大力支持與幫助。

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