選擇性環氧化酶2抑制劑NS－398對胃癌細胞AGS增殖的抑制作用

胡孫寬，周 琴，林鐵素，楊云秀，潘鈺婷，陳必成，金 嶸

(溫州醫學院附屬第一醫院1.消化內科，2.肝膽胰外科，4.流行病學教研室，浙江溫州 325000;3.九江市第一人民醫院ICU，江西九江 332000)

由于目前無有效的方法發現早期胃癌，絕大多數胃癌發現時已進入進展期，而進展期胃癌預后差，故急需新穎的有效的治療方案。Notch信號通路被認為在維持干細胞和祖細胞種群在細胞增殖、分化和凋亡中的平衡有重要的作用[1]。同時在多種腫瘤形成過程中，Notch信號通路也起著重要作用[2－3]。抑制Notch信號通路能抑制胃癌細胞增殖[4]。但是，Notch信號通路在胃癌形成過程中的調節機制仍尚未明了。已有研究表明，胃癌中環氧化酶(cyclooxygenase－2，COX－2)表達明顯升高，是胃癌不良預后一個獨立因素[5]。COX－2抑制劑誘導胃癌細胞凋亡，并呈劑量依賴性地抑制裸鼠胃癌的生長[6]。但是COX－2抑制劑誘導胃癌細胞凋亡的機制并未完全清楚。前期研究表明，COX－2和Notch細胞內結構域(Notch intracellular domain，NICD)在胃癌中表達呈正相關[7]。為此，本研究通過COX－2抑制劑 NS－398與胃癌細胞 AGS共培養，檢測AGS細胞的增殖、凋亡和Notch信號通路相關基因的表達，并探討NS－398誘導AGS細胞凋亡的機制，為胃癌基因靶向治療提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

NS－398購自碧云天生物技術研究所;F12培養基、青霉素、鏈霉素和Trizol購自Gibco BRL公司;胎牛血清購自Hyclone公司;CCK－8試劑盒購自日本株式會社同仁化學研究所。DMSO，AnnexinⅤ－FITC/PI雙染法細胞凋亡檢測試劑盒和胰蛋白酶為Sigma公司產品;PCR引物(表1)由上?；瞪锛夹g有限公司設計合成;逆轉錄試劑盒購自Fermentas公司;SYBR Green實時熒光定量PCR試劑盒購自ABI公司;兔抗人NICD抗體和PVDF膜購自Millipore公司;兔抗人毛蛋白和斷裂1增強子(hairy and enhancer of split 1，Hes－1)抗體購自Abcam公司;兔抗人NF－κB抗體購自Cell Signaling公司;兔抗人GAPDH抗體購自杭州賢至生物技術有限公司;辣根過氧化物酶標記的二抗羊抗兔IgG抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司;蛋白質定量試劑盒和電化學發光試劑盒為美國Pierce公司產品;X線膠片為日本柯達公司產品;其他試劑為國產分析純。ELX800酶標儀為 Bio－Tek產品;ABI7500實時熒光定量PCR儀為ABI公司產品。

Tab.1 Primers used for real－time PCR

1.2 細胞培養和藥物配制

胃癌細胞AGS購自中國科學院上海細胞庫，培養基為含10%的胎牛血清、青霉素100 U·L－1和鏈霉素100 μg·L－1的 F12 培養基，培養在37℃，5%CO2孵箱中。2 d換液1次，3 d傳代1次。NS－398用DMSO溶解，配制成50 mmol·L－1。儲存在 －80℃冰箱。用無血清F12培養基稀釋成所需的工作濃度。

1.3 CCK－8 法檢測細胞存活率

取對數生長期的AGS細胞，胰酶消化后，調整成8 ×107L－1，接種于96 孔培養板中，每孔加100 μl，常規培養過夜，細胞貼壁后，換無血清F12培養基培養24 h，加入不同濃度的 NS－398，使終濃度為25，50和100 μmol·L－1，并設置細胞對照組(不加藥物)和空白對照組(只加培養基不加細胞)，每組設3個復孔。分別培養12，24和48 h后，每孔加入CCK－810 μl，2 h后用酶標儀上在波長450 nm處檢測各孔吸光度(A)值。實驗重復3次。胃癌細胞存活率(%)=(實驗組A450nm－空白對照組A450nm)/(細胞對照組A450nm－空白對照組A450nm)×100%。

1.4 流式細胞術檢測細胞凋亡率

同樣取對數生長期的細胞，調整細胞密度為2×108L－1，接種于6孔培養板中。藥物處理和實驗分組同上。藥物作用48 h后，收集細胞，按照AnnexinⅤ－FITC/PI雙染法細胞凋亡檢測試劑盒說明書，用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.5 實時熒光定量PCR檢測Notch信號通路相關基因的表達

取對數生長期的細胞，接種于6孔培養板，加入NS－39850 μmol·L－1(終濃度)作用 24 h，提取總RNA。按逆轉錄試劑盒說明書逆轉錄成cDNA。熒光實時定量PCR步驟參照ABI說明書進行，反應體系共20 μl，其中 cDNA 1 μl，上下游引物各2 μl，PCR Master Mix 10 μl，去酶水 5 μl。目的基因的相對表達水平由目的基因的2－ΔΔCt/GAPDH 的2－ΔΔCt比值表示。

1.6 Western印跡法檢測Notch信號通路相關蛋白的表達

取對數生長期細胞，接種于6孔培養板，與NS－39850 μmol·L－1作用48 h，用RIPA裂解液裂解細胞，提取總蛋白。BCA法檢測蛋白質濃度。常規SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉至PVDF膜上。5%脫脂牛奶封閉后，加入一抗孵育(抗 NICD:1∶500，抗 Hes－1:1∶1000，抗 NF－κB2:1∶1000，抗GAPDH:1∶500)，PBS 清洗后二抗孵育，ECL 發光，暗室X線膠片曝光。掃描膠片后，使用Image J圖像分析軟件測定蛋白條帶積分吸光度(integrated absorbance，IA)，待測蛋白相對表達水平用IA目標蛋白/IAGAPDH比值表示。

1.7 統計學分析

2 結果

2.1 NS－398對AGS細胞增殖的抑制作用

由圖1看出，隨著藥物濃度的增加和作用時間的延長，NS－398對AGS細胞增殖的抑制作用明顯增強，并呈時間和濃度依賴性(圖1)。對48 h不同濃度25，50和100 μmol·L－1(x)和存活率(y)進行回歸分析，得到回歸方程 y=－0.537x+77.55(r濃度=－0.999，P=0.027)，根據此公式可得 48 h的 IC50為51.34 μmol·L－1。對 NS－39850 μmol·L－1與AGS細胞作用12，24和48 h(x)和存活率(y)進行回歸分析，得回歸方程 y=－1.30x+111.92(r時間=－1.00，P=0.003)。

Fig.1 Effect of NS－398 on AGS cell survival.AGS cells were treated with NS－398 and measured by CCK－8 assay.±s，n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control(0)group.

2.2 NS－398對AGS細胞凋亡的影響

流式細胞術結果顯示，正常對照組早期凋亡右下象限為(3.5±1.4)%，NS－39850 μmol·L－1作用于AGS細胞48 h后，細胞早期凋亡率明顯升高，達到(20.1±3.5)%(n=3，P＜0.05)(圖2)。

Fig.2 Effect of NS－398 on apoptosis of AGS cells detected with flow cytometry.AGS cells were cultured with NS－39850 μmol·L－1for 48 h.A:normal control;B:NS－39850 μmol·L－1.

2.3 NS－398對AGS細胞Notch信號通路相關基因mRNA表達的影響

Fig.3 Effect of NS－398 on mRNA expression of some genes related to Notch signal transduction in AGS cells.AGS cells were cultured with NS－39850 μmol·L －1for 24 h.mRNA expression was determined with real－time PCR and expressed as the ratio of 2－ΔΔCtof target gene/2－ΔΔCtof GAPDH.±s，n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

如圖3所示，NS－39850 μmol·L－1作用24 h，NF－κB2 mRNA 表達顯著低于對照組(t=5.08，P=0.007)Hes－1 mRNA 表 達 顯 著 低 于 對 照 組(t=3.4，P=0.027)。Notch 信號通路的配體鋸齒狀 1(jagged－1，JAG1)和 δ 樣 1(delta－like 1，DLL1)及Notch信號通路的受體Notch1和Notch2 mRNA表達未發現明顯的變化。

2.4 NS－398對AGS細胞 NICD蛋白表達的影響

NS－39850 μmol·L－1與 AGS 細胞作用 48 h，NICD，NF－κB2和Hes－1蛋白表達明顯低于對照組(P＜0.05)(圖4)。

Fig.4 Effect of NS－398 on expression of NF－κB2，NICD and Hes－1 in AGS cells.AGS cells were cultured with NS－39850 μmo·lL－1for 48 h.The protein expression was measured with Western blotting(A)and expressed as the ratio of integrated absorbance of target protein/ingegated absorbance of GAPDH(B).Lane 1，normal control;lane 2，NS－398 group.±s，n=3.*P＜0.05，compared with normal control group.

3 討論

COX是前列腺素合成過程中非常重要的限速酶。COX－2是一種誘導酶，在正常生理條件下檢測不到其表達，只有當受到相應的刺激時才開始合成。以前認為COX－2與炎癥的發生密切相關，目前認為COX－2和腫瘤的發生也密切相關，其中包括胃癌。我們的前期研究已表明，COX－2表達增加與胃癌細胞分化、浸潤和轉移密切相關，COX－2也可反映胃癌的惡性程度并提示胃癌患者的預后[7]。

Notch信號通路在胃癌的發生發展中起著重要作用[9]，主要是通過下游靶基因產生生物學作用。下游的靶基因中，最為典型的靶基因為Hes和Hes相關的家族，該基因轉而調節下游基因的表達[10]，如Hes－1表達減少能夠促進細胞周期依賴蛋白CDKN1C/P57的表達從而促進細胞衰老[11]，同時NF－κB也被證實是 Notch1 信號通路的靶基因[12]。通過用γ－分泌酶抑制劑(阻斷Notch受體激活的藥物)阻斷Notch信號通路，能夠減少結腸癌對奧沙利鉑(oxaliplatin)的耐藥性，從而促進奧沙利鉑對結腸癌的療效[10]。抑制Notch信號通路能下調抗凋亡基因bcl-2表達，上調bax表達[13]，并且認為抑制Notch信號通路能夠促進P21的表達，減少周期蛋白A的表達[14]，提示抑制Notch信號通路能夠促進細胞凋亡的發生。因此，通過抑制Notch信號通路來抑制胃癌細胞的增殖可能成為治療胃癌的有效方法。本研究結果表明，NS－398可使AGS細胞NICD表達明顯減少，提示Notch信號通路受到明顯的抑制，NS－398抑制胃癌細胞增殖可能與Notch信號通路的抑制有關。

NF－κB2作為Notch信號通路的靶基因，具有抗細胞凋亡功能，涉及多個信號通路，過程復雜，主要通過上調或者誘導抗凋亡基因的表達而實現[15]。由于這些基因調節點上有NF－κB的結合位點，其表達產物通過抑制細胞凋亡的線粒體途徑或者死亡受體途徑發揮作用[16]。本研究結果表明，NS－398可使胃癌細胞AGS NF－κB2表達明顯減少，提示可能通過該途徑促進了胃癌細胞的凋亡。據報道，COX－2抑制劑治療癌癥所需的劑量比減少COX－2酶激活的劑量要少很多，從而推測該抑制劑的激活可能有多個模式[17]。曾有研究認為，抑制COX－2主要通過抑制前列腺素的合成而阻止其生物學作用。隨后研究報道，COX－2抑制劑能通過 Fas介導的途徑調節PTEN－AKt通路而誘導胃癌細胞凋亡[18]。本研究結果表明，NS－398能有效地抑制胃癌細胞AGS增殖，明顯減少Notch靶基因Hes－1和NF－κB2 mRNA的表達，但并不影響Notch信號的配體(DLL1和JAG1)及受體(Notch1和Notch2)mRNA的變化。Western印跡實驗結果表明，NS－398能減少NICD，Hes－1和NF－κB2蛋白的表達。綜合上述結果提示，NS－398可能部分通過抑制 NICD的表達來阻斷Notch信號通路，減少其靶基因Hes－1和NF－κB2的表達，進而抑制AGS細胞增殖，促進AGS細胞凋亡。

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