外源激素對二齡圓斑星鰈卵巢發育誘導效果的初步研究

徐永江, 柳學周*, 王妍妍

(1. 中國水產科學研究院 黃海水產研究所 農業部海洋漁業可持續發展重點實驗室, 山東 青島， 266071；2. 中國水產科學研究院 黃海水產研究所 青島市海水魚類種子工程與生物技術重點實驗室，山東 青島， 266071)

圓斑星鰈(VeraspervariegatusT.&S.)屬鰈形目(Pleuronectiformes)，鰈科(Pleuronectidae)，星鰈屬(Verasper)，主要分布于我國黃海、渤海、東海以及日本，朝鮮等海域，其肉質鮮嫩，營養價值和商業價值高，是一種極具人工養殖和資源增殖開發利用前景的優良魚種。自上世紀90年代以來，研究者們一直在試圖通過控制其繁殖周期來實現該魚種的人工繁殖，并在資源調查[1-2]、親魚培育和激素誘導產卵[3]方面進行了積極嘗試和研究，積累了較多有關繁殖生物學的基礎資料。

資源調查資料表明，自然條件下圓斑星鰈雌性親魚性成熟的最低年齡為3齡[4]。目前，圓斑星鰈在人工養殖條件下，人工雌性親魚甚至4齡以上才能真正用于人工繁殖，且經人工調控后產卵的成功率也相對較低，人工采卵獲得優質卵子的幾率不高。近年來研究產卵使用的親魚都是自然海域捕獲的野生親魚在人工條件下馴養后用于繁殖，子一代親魚的人工繁殖少有成功。由于自然資源的嚴重下降，自然海域的圓斑星鰈種群逐年縮小，因此從人工養殖群體選擇具備優良性狀的個體來補充親魚群體是保證養殖產業可持續發展的重要途徑，對于可用于繁殖群體補充的后備親魚個體，其生殖特性和生殖潛力是評價其可否作為后備親魚的必要條件[5]。

外源激素可誘導人工養殖魚類性腺發育成熟并排卵[6]，還可加速魚類性腺成熟[7]、克服人工養殖條件下的親魚發育不良不能正常排卵的情況[8-10]。因此，我們利用外源激素誘導2齡雌性圓斑星鰈后備，以卵巢發育特征和性類固醇激素表達水平變化為指標，以期認識圓斑星鰈2齡后備親魚的生殖內分泌特性，評價其在人工養殖條件下的生殖潛力，為人工親魚的優選和群體構建提供理論和技術支持。

1 材料與方法

1.1 實驗條件及實驗設計

于2010年在青島忠海水產有限公司開展了3齡以上圓斑星鰈親魚(全長39～62 cm，體重1 200～2 800 g)的促熟調控產卵研究，使用2個容積為25 m3的圓形水泥池作為親魚培育池，培育親魚數量75尾。親魚餌料為活沙蠶、貝肉。日投喂2次，投喂量為魚體重的2%～3%，及時清除殘餌、排污。對親魚進行溫度和光照調控，培育池以黑色不透光幕布圍遮，水溫由自然海水和地下井水混合調控。光照由白熾燈(60 W)提供，調節水面光照強度為280 lx。產卵期結束后，親魚重新置于自然光照和水溫下。親魚培育條件：周年培育水溫8～23 ℃，鹽度29～32，pH 7.8～8.2，溶解氧6 mg/L以上，日換水率300%～500%。親魚周年培育水溫和光周期變化見圖1。

本實驗使用2齡的圓斑星鰈子一代人工后備親魚45尾，實驗魚全長300～380 mm，體重565～780 g。本研究使用的F1代2齡圓斑星鰈后備親魚與達性成熟的親魚共同培育，于2009-10開始進行溫光調控。

圖1 親魚周年培育水溫和光照時間變化Fig.1 Year round photothermal conditioning schedule used to mature captive broodstocks

本實驗于2010-03進行，當性成熟親魚性腺隆起較為明顯且發育達IV期以上時，將30尾2齡實驗用親魚從培育池取出，用于激素誘導發育試驗，剩余的15尾實驗魚留在親魚池繼續進行培育。實驗魚自親魚培育池取出后，在4 m3的方形水泥池中開展實驗，實驗設置3個組，共使用水泥池3個，每個實驗組放置實驗魚10尾。實驗魚培育條件和餌料投喂及管理同親魚培育池。實驗共持續3周。實驗用激素購自寧波第二激素廠(寧波，中國)，實驗組別、使用激素種類、注射劑量及使用親魚數量見表1。實驗魚在實驗池中適應3 d后開始實驗，實驗開始時(0 h)每尾魚按照設計劑量注射生理鹽水及激素，在48 h時進行二次注射，劑量同第1次。激素注射前，先以160 mg/L的MS-222麻醉實驗魚，使用1 mL的無菌注射器在實驗魚背部肌肉部位進行激素誘導注射。

表1 實驗使用激素種類、注射劑量及使用親魚數量Table 1 The hormones, dosage and number of fish used in the present study

注：“-”為進行任何激素和生理鹽水處理

1.2 取樣方法及樣品處理

血液取樣：對以生理鹽水、GnRH和LHRH處理的實驗魚定時抽取血液。在第1次激素注射后的6 h、12 h、24 h、48 h、96 h、192 h和實驗結束時分別抽取血液樣品，每次取樣實驗魚5尾。血液取樣時，實驗魚以160 mg/L的MS-222麻醉后置于鋪有干凈濕潤毛巾的泡沫板上進行。取血使用1 mL無菌注射器，采用背面尾靜脈抽血方法，每尾魚抽血1 mL，保存在1.5 mL eppendorf離心管中，15 000 r/min離心10 min后，分離上層血清，保存在-40 ℃備用。

組織樣品取樣：在實驗開始前、192 h分別取樣4個實驗組的實驗魚各3尾，在實驗結束時(480 h)將實驗魚全部取樣。取樣實驗魚時，首先將實驗魚使用MS-222(300 mg/L)麻醉致死，小心解剖取出性腺、肝臟在Davis固定液中固定24 h后轉入70 %酒精保存。性腺樣品經酒精梯度(70%～100%)脫水，石蠟包埋，切成7～9 μm厚的切片，蘇木精伊紅染色后，中性樹膠封片，在顯微鏡下觀察(NIKON)，拍照。

在取樣過程中，對實驗魚進行生物學測量，包括體重(BW)、體長(BL)、內臟重(VW)、性腺重(GW)、肝臟重(LW)。分別計算性腺指數(GSI)=[GW/(BW-VW)]×100%；肝臟指數(HSI)=[LW/(BW-VW)]×100%；肥滿度(CF)=[BW/(BL)3]×100%。

1.3 性類固醇激素水平測定

采用放射免疫法(RIA)對雌二醇(E2)和睪酮(T)進行測定。使用125I標記的哺乳動物E2和T放射免疫測定試劑盒(天津九鼎醫學生物工程有限公司)。T回收率95%～108%，靈敏度1.9 ng/dl，批內變異系數7.4%，批間變異系數9.8%，其特異性表達為與雙羥睪酮交叉反應率≤1.6×10-4，雄烯二酮≤2.1×10-6，孕酮(PROG)≤5.0×10-6，雌三醇(E3)≤5.2×10-8，E2≤5.0×10-4。E2回收率95%～104%，靈敏度2.1 pg/mL，批內變異系數7.7%，批間變異系數8.9%，其特異性表達為與E3交叉反應率≤9.0×10-4，PROG≤1.0×10-4，T≤1.0×10-4，雌酮≤7.0×10-3，膽固醇≤1.0×10-5。試劑盒非特異性結合率≤3%，特異性結合率≥30%。

1.4 數據處理和統計分析

試驗結果均表示為平均值±S.D.的形式，使用SPSS(16.0版本)軟件進行差異顯著性分析。利用單因素方差分析法(ANOVA)檢測GSI、HSI、CF、血漿雌二醇、睪酮的表達水平變化以及肝臟細胞直徑的變化，取差異顯著性(P)為0.05，P≤0.05視為差異顯著，反之不顯著。

2 結 果

本研究表明，留在親魚培育池繼續培育的實驗魚未能排卵，組織切片檢查發現性腺僅發育至Ⅳ期后，而采用注射法進行外源激素誘導子一代2齡后備雌性親魚性腺中卵母細胞可發育至5時相早期，雖然最終也未能達到成熟排卵，但表明外源激素誘導對性腺發育起到了積極的促進作用。

2.1 卵巢數量特征變化

實驗結束時，GnRH處理組圓斑星鰈雌魚有40%可見卵巢部位的隆起，而Control組、LHRH組以及自然溫光組未見親魚卵巢部位的隆起。實驗結束時，GnRH組實驗魚的GSI值最大，達到11.51±2.64，而LHRH處理組實驗魚相對較小為8.36±1.82，最小的為對照組僅為3.76±1.15，自然溫光組為4.23±1.55。GnRH處理組和LHRH處理組實驗魚的肝重指數(0.84～0.96)和肥滿度(0.61～0.82)都大于對照組和自然溫光組(0.65～0.79)，但差異不顯著(P>0.05)。

2.2 血漿性類固醇激素的表達水平變化

對照組親魚血漿性類固醇激素表達水平變化不顯著，雌二醇表達水平在48 h達峰值，其后保持一定的表達水平的波動。LHRH組雌魚血漿雌二醇水平在激素注射6 h后顯著升高(P<0.05)，隨后又顯著下降，雖在24 h又有升高，但在其后的時間表現相對穩定的變動，在48 h進行LHRH組二次注射后，激素水平僅在72 h稍微上升，在其后的實驗過程中保持相對穩定的水平。GnRH組雌魚血漿雌二醇水平表現出與LHRH組類似的表達變化規律，但144 h前雌二醇表達水平都高于LHRH組(除72 h)，其后其表達水平低于LHRH組雌魚。上述組雌二醇的表達水平在72 h后都低于對照組雌魚血漿的雌二醇表達水平(圖2)。

對照組親魚血漿睪酮表達水平在144 h達峰值，其后逐漸下降。各實驗組雌魚血漿睪酮表達水平也發生較為明顯的波動。在LHRH組，第一次激素注射后，血漿睪酮表達水平顯著下降至12 h時低于檢測限，其后在48 h達峰值(P<0.05)，在第二次注射后睪酮表達水平逐漸下降并保持相對較低。GnRH組呈現類似的表達規律，但在48 h后的血漿睪酮表達水平相對高于LHRH組。另外，除48 h、72 h和96 h外，對照組雌魚血漿中睪酮表達水平都高于實驗組(圖3)。

圖2 激素誘導后血漿中雌二醇表達水平變化Fig. 2 Serum estradiol expression level after hormones treatment

圖3 激素誘導后血漿中睪酮表達水平變化Fig.3 Serum testosterone expression level after hormones treatment

2.3 卵巢中卵母細胞組成變化

圓斑星鰈卵巢發育和卵母細胞發育的特征及其劃分參見徐永江等[11]的描述，本研究觀察到的卵母細胞發育特征見圖4。

對取樣的實驗魚卵巢進行組織切片觀察，發現對照組親魚卵巢中卵母細胞組成為4時相早期、3時相、2時相卵母細胞，以2時相卵母細胞占據優勢，表明2齡雌性親魚卵巢發育可進入卵黃發生期，但在較長時間內保持不變，卵母細胞不能繼續發育成熟。自然溫光組親魚卵巢發育情況與對照組親魚基本相似。

使用外源激素誘導192 h后，LHRH處理組雌魚卵巢內卵母細胞組成為4時相、3時相和2時相卵母細胞，只不過3時相和2時相卵母細胞比例相對減少，4時相卵母細胞比例增加，且4時相卵母細胞可發育到中后期。至實驗結束時(480 h)，性腺中可見少量發育至5時相的卵母細胞，其特點為核仁和核膜崩解， 4時相卵母細胞多數為發育至中后期的卵母細胞。

GnRH處理組雌魚在192 h取樣時，卵巢中可見3種類型的卵母細胞，分別為4時相、3時相、2時相，與LHRH處理組不同的是3時相卵母細胞較多。至實驗結束時(480 h)，卵巢中發育至4時相的卵母細胞數量急劇增加，并可見個別5時相卵母細胞。性腺中5時相卵母細胞比例增加明顯達20%，但僅處于5時相發育早期，不能發生水合作用而成熟。

a．2時相卵母細胞；b. 3時相卵母細胞；c.4時相卵母細胞；d. 5時相早期卵母細胞

2.4 肝細胞直徑變化

本研究發現,對照組和自然溫光組實驗魚肝細胞直徑在實驗過程中未有較大變化，約為11.6～12.2 μm。LHRH處理組雌魚的肝細胞在激素誘導48 h后直徑增大為15.8～16.5 μm(P<0.05)，但在192 h又有所降低，至480 h最低為13.2 μm，仍然高于對照組，但同對照組無顯著差異(P>0.05)。GnRH處理組雌魚肝細胞直徑在192 h才開始增大，直徑達16.4 μm，高于LHRH組的最大直徑，其后在480 h略有降低，但仍保持在15 μm以上，遠高于對照組實驗魚(P<0.05)。結果表明，外源GnRH誘導對肝臟細胞大小的影響較為明顯。LHRH處理組和GnRH處理組實驗魚CF的增加與肝細胞直徑增大相對應(圖5)。

圖5 激素誘導后肝臟細胞直徑的變化Fig.5 The cChanges in of hepatocytes diameter after exogenous hormones treatment

3 討 論

本研究首次利用外源激素誘導方法，探討了外源激素GnRH和LHRH對子一代人工二齡圓斑星鰈雌性后備親魚卵巢發育的誘導效果。結果表明在外源激素誘導下，2齡雌性親魚卵母細胞可以發育至5時相，但不能達到水合成熟，部分實驗魚可見卵巢的體表隆起，但是未能獲得排卵，在實際生產過程中應使用3齡以上的性成熟親魚。

3.1 外源激素誘導與內源性激素表達水平變化的關系

本研究觀察到，在外源激素誘導后，圓斑星鰈血漿性類固醇激素表達水平先是顯著升高而后顯著下降，表明外源激素影響了內源性類固醇激素的合成和分泌[10]。利用外源緩釋激素GnRH對塞內加爾鰨(Soleasenegalensis)2 齡雌性親魚進行成熟誘導，結果表明激素誘導后 1 d內，親魚血漿性類固醇激素表達水平在短時間內(6 h)迅速升高至峰值并在隨后下降至與對照組類似水平，睪酮出現峰值的時間晚于雌二醇[13]，這與本研究結果類似。在其它海水硬骨魚類如大西洋鰈(Pleuronectesferrugineus)[14]、金眼狼鱸(Moronechrysops)[6]和條紋婢魚 (Latrislineata)[15]、扁海鰈(Pleuronectesplatessa)中也存在相同趨勢的血漿性類固醇激素表達變化[16]。人為操作的壓力可能也會對實驗魚的血漿性類固醇激素表達水平起到抑制作用[17]，在綠背菱鲆(Phombosoleatapirina)中，實驗過程的注射采樣操作和日常培育操作會對親魚血漿性類固醇激素表達水平帶來抑制效應[18]。

3.2 外源激素誘導方式與性腺發育的關系

本研究采用兩次重復注射外源激素的方式誘導圓斑星鰈雌性親魚性腺發育成熟，雖然可促進卵母細胞發育至Ⅴ期早期，但是不能達到水合成熟而排放，也未能觀察到親魚的排卵。以往研究證明，對海水硬骨魚類進行外源激素誘導成熟產卵，單次的注射誘導與多次注射誘導及緩釋埋植激素誘導的效果存在較大差異，以單次注射誘導的效果最差，多次注射誘導相對較好，但是多次重復操作可能會對親魚造成生殖脅迫[8]。另外，注射法將激素注入魚體后，激素在魚體代謝系統內的消除時間(持續有效時間)相對較短，如在塞內加爾鰨中，采用注射GnRH的方法誘導親魚成熟，血漿中GnRH在3 d后已消除，無法檢測到[13]，在美洲鰈(Pleuronectesamericanus)中為 3 d[19]，而在細點牙鯛(Dentexdentex)中僅為24 h[20]。本研究的親魚最終成熟和排卵的失敗也可能與采用的注射方法有關，外源激素進入魚體后被魚體自身內分泌系統和代謝系統快速消解。與注射法相比較，目前最為常用的是激素的緩釋系統，植入魚體內后可較長時間持續釋放GnRH，如采用緩釋系統誘導大西洋擬庸鰈(Hippoglossushippoglossus)性腺成熟產卵，血漿中GnRH可在1個月內保持較高水平[21]，而細點牙鯛(Dentexdentex)接受外源激素埋植處理后血漿性激素水平可在24 d內保持較高水平[20]，而且對親魚生殖脅迫小，親魚的產卵效果較注射法或個別自然產卵為好。另外，對于尚未達到生理性成熟的人工親魚，采用緩釋系統埋植外源激素可誘導性腺成熟排卵，如利用以共聚物作為緩釋載體的GnRH可誘導未性成熟的真鯛(Pagrusmajor)達到性成熟并排卵[22]，對美洲鰈未性成熟親魚采用外源激素誘導，可促進性腺發育成熟的進程，同時血漿性類固醇激素激素出現于本研究類似的表達水平變化，這對于了解其在人工養殖條件下的繁殖生物學特性和周年產卵調控具有重要的應用價值[23]。盡管多數研究表明，外源激素進入魚體后的消解期長短因為埋置方法和劑量、魚種代謝水平、水溫的不同而差異較大[24]，但是實踐結果已證明采用緩釋系統對于解決人工養殖魚類的生殖功能障礙和成功誘導產卵較注射法更為可行。在即將開展的下一步研究中，筆者將采用緩釋系統繼續開展外源激素對親魚的誘導成熟產卵研究，另外結合溫光調控促熟措施，以比較這幾種方法的效果及緩釋系統能夠并成功獲得卵母細胞的水合成熟及產卵。

由于不同的激素在促進硬骨魚類性腺發育成熟方面的效能差別較大且具有種的特異性，因此研究者針對不同的魚種選擇使用不同種類的激素[25]。目前，在已經研究過的魚種和激素種類中，GnRH被認為是最有效的外源激素，另外LHRH和HCG因為獲取相對容易且價格相對低廉也在水產養殖領域較為廣泛的使用。本研究表明，對于圓斑星鰈，GnRH和LHRH的誘導成熟的效果類似，未有太大區別，這可能與圓斑星鰈本身的生殖內分泌特性有關。

3.3 外源激素誘導與卵巢及肝臟組織學特征變化的關系

本研究未能獲得雌性親魚卵巢中卵母細胞的完全水合成熟和排卵，但是經激素誘導后，卵巢中卵母細胞組成發生明顯變化，兩種外源激素處理的親魚卵母細胞都可以達到5時相早期，表明外源激素可能通過腦-下丘腦-性腺(BPG)軸促進了卵巢發育，同時GSI值的增加也驗證了雌魚卵巢的發育。

研究表明，肝臟是魚類脂肪和能量的重要儲備基地并與產卵進程密切相關[12]，但目前尚未有明確報道證實肝臟體積的變化與雌魚卵巢發育的關系。本研究觀察到激素誘導后，圓斑星鰈2齡雌魚HSI增加，肝細胞直徑增大，這些特征與其它一些硬骨魚類在繁殖過程表達出的特征變化相似。這些變化都間接表明，外源激素誘導下肝臟可能通過卵黃蛋白原的合成和傳遞作用參與了卵母細胞成熟的調節。

參考文獻(References)：

[1] WADA T, MITSUNAGA N, SUZUKI H, et al. Growth and habitat of spotted halibutVeraspervariegatusin the shallow coastal nursery area, Shimabara Peninsula in Ariake Bay, Japan [J]. Fisheries Science, 2006, 72: 603-611.

[2] DOU S Z. Food utilization of adult flatfishes co-occurring in the Bohai Sea of China [J]. Netherlands Journal of Sea Research, 1995, 34 (1-3): 183-193.

[3] BAEK H J, KIM Y, AN C M, et al. Effects of hormonal treatment on induced maturation and ovulation in the spotted halibut,Veraspervariegatus[J]. Journal of Aquaculture, 2000, 13(1): 47-53.

[4] DEN J Y, MENG T X, REN S M, et al. Species composition, abundance and distribution of fishes in the Bohai Bay [J]. Marine Fisheries Research, 1988, 9: 10-98. 鄧景耀, 孟田湘, 任勝民, 等.渤海魚類種類組成及數量分布[J]. 海洋水產研究, 1988, 9: 10-98.

[5] DAHLE R, TARANGER G L, KARLSEN ?, et al. Gonadal development and associated changes in liver size and sexual steroids during the reproductive cycle of captive male and female Atlantic cod (GadusmorhuaL.) [J]. Comp. Biochem. Physol.A. Mol. Integr. Physiol., 2003, 136(3): 641-653.

[6] MYLONAS C C, SCOTT A P, VERMEIRSSEN E L, et al. Changes in plasma gonadotropin II and sex-steroid hormones, and sperm production of striped bass after treatment with controlled-release gonadotropin-releasing hormone agonist delivery systems[J]. Biol. Reprod.,1997, 57:669-675.

[7] KOMATSU T, BHANDARI R K, KOBAYASHI Y, et al. GnRHa-accelerated spermatogenesis in the testes of underyearling golden rabbitfish,Siganusguttatus(Bloch) [J]. Aquaculture, 2006, 257: 558-565.

[8] ZOHAR Y, MYLONAS C C. Endocrine manipulations of spawning in cultured fish: from hormones to genes[J]. Aquaculture, 2001, 197: 99 136.

[9] ANDO M, NIHO H, TSUKAMASA Y, et al. Valuation of cultured spotted halibutVeraspervariegatusby comparing with cultured plaice Paralichthys olivaceus[J]. Nippon Suisan Gakkaishi, 1998, 64(6):1027-1033.

[10] MYLONAS C C, ZOHAR Y. Use of GnRHa-delivery systems for the control of reproduction in fish [J]. Reviews in Fish Biology and Fisheries, 2000, 10(4): 463-491.

[11] XU Y J, LIU X Z, LIU J G, et al. Histological and morphometric studies on the annual gonadal maturation cycle of spotted halibutVeraspervariegatus[J]. Progress in Fishery Sciences, 2011, 32(3): 7-15. 徐永江, 柳學周, 劉君剛, 等.圓斑星鰈卵巢發育的組織學和數量形態特征研究[J]. 漁業科學進展, 2011, 32(3): 7-15.

[12] KJESBU O S. A simple method for determining the maturity stages of Northeast Arctic cod (Gadus morhua L.) by in vitro examination of oocytes [J]. Sarsia, 1991,75: 335-338.

[13] GUZMAN J M, RAMOS J, MYLONAS C C, et al. Spawning performance and plasma levels of GnRHa and sex steroids in cultured female Senegalese sole (Soleasenegalensis) treated with different GnRHa-delivery systems[J]. Aquaculture, 2009, 291 (3-4): 200-209.

[14] LARSSON D G J, MYLONAS C C, ZOHAR Y, et al. Gonadotropin releasing hormone-analogue (GnRH-A) advances ovulation and improves the reproductive performance of a cold-water batch-spawning teleost, the yellowtail flounder (Pleuronectesferrugineus)[J]. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences, 1997, 54: 1957-1964.

[15] MOREHEAD D T, PANKHURST N W, RITAR A J. Effect of treatment with LHRH analogue on oocyte maturation, plasma sex steroid levels and egg production in female striped trumpeterLatrislineata(Latrididae)[J]. Aquaculture, 1998, 169: 315-331.

[16] SCOTT A P, WITTHAMES P R, VERMEIRSSEN E L M, et al. Prolonged-release gonadotrophin-releasing hormone analogue implants enhance oocyte final maturation and ovulation, and increase plasma concentrations of sulfated C21steroids in North Sea plaice [J]. Journal of Fish Biology, 1999, 55: 316-328.

[17] PANKHURST N W, VAN D K G. Effects of stress on reproduction and growth of fish. Fish stress and health in aquaculture. Society for Experimental Biology Seminar Series 62[M]. Cambridge: Cambridge University Press, 1997: 73-93.

[18] BARNET C W, PANHURST N W. The effects of commom laboratory and husbandry practices on the stress response of greenback flounderRhombosoleatapirina(Günther, 1862) [J]. Aquaculture, 1998, 162: 313-329.

[19] HARMIN S A, CRIM L W. Influence of gonadotropin hormone-releasing hormone analog (GnRH-A) on plasma sex steroid profiles and milt production in male winter flounder,Pseudopleuronectesamericanus(Walbaum) [J]. Fish Physiol. Biochem., 1993, 10: 399-407.

[20] GREENWOOD L N, SCOTT A P, VERMEIRSSEN E L, et al. Plasma steroids in mature common dentex (Dentexdentex) stimulated with a gonadotropin-releasing hormone agonist [J]. Gen. Comp. Endocrinol., 2001, 123:1-12.

[21] VERMEIRSSEN R L M, SHILEDS R J, MAZORRA Q C, et al. Gonadotropin-releasing hormone agonist raises plasma concentrations of progestogens and enhances milt fluidity in male Atlantic halibut (Hippoglossushippoglossus) [J]. Fish, Physiol. Biochem., 2000, 22: 77-87.

[22] MATSUYAMA M, HAMADA M, ASHITANT T, et al. Development of LHRH-a copolymer pellet polymerized by ultraviolet and its application for maturation in red sea breamPagrusmajorduring the non-spawning season [J]. Bull. Jpn. Soc. Sci. Fish, 1993, 59(8):1361-1369.

[23] HARMIN S A, CRIM L W, WIEGAND M D. Manipulation of the seasonal reproductive cycle in winter flounder,Pleuronectesamericanus, using a gonadotropic hormone releasing hormone [J]. Marine Biology, 1995, 121: 611-619.

[24] KING H R, PANKHURST N W. Effect of maintenance at elevated temperatures on ovulation and luteinizing hormone releasing hormone analogue responsiveness of female Atlantic salmon (Salmosalar) in Tasmania [J]. Aquaculture, 2004, 223: 583-597.

[25] POORTENAAR C W, PANHURST N W. Effect of Luteinizing Hormone-Releasing Hormone Analogue and Human Chorionic Gonadotropin on Ovulation, Plasma and Ovarian Levels of Gonadal Steroids in Greenback FlounderRhombosoleatapirina[J]. Journal of the World Aquaculture Society, 2000, 31(2): 175-186.