鐵皮石斛甘露糖結合凝聚素的分子建模與對接研究

朱夢麗，朱乾坤，鄒嘉欣，馮沛春，范高韜，王萬軍

(西南交通大學生命科學與工程學院，成都610031)

凝集素(lectin)［1］是一種非免疫源性蛋白，能專一識別特定的糖類并與之可逆共價結合，形成可使細胞凝集的糖蛋白，廣泛分布于植物，動物和微生物中。植物凝集素存在于很多植物的種子和營養組織中，根據氨基酸序列的同源性及其進化關系，可以分為7個家族:豆科凝集素、單子葉植物甘露糖結合凝集素(Monocot mannose-binding lectin，MBL)、含橡膠素結構域的幾丁質結合凝集素、II型核糖體失活蛋白、葫蘆科韌皮部凝集素、木菠蘿素相關凝集素和莧科凝集素［2］。單子葉植物MBL存在于石蒜科、百合科、蘭科等植物中，可特異結合甘露糖。甘露糖在植物中的分布很少，但卻廣泛分布于昆蟲、病毒、細菌、真菌的表面，當植物組織受昆蟲或高等動物襲擊時，MBL就從受襲擊的細胞中釋放至捕食者的消化道，通過消化道細胞上的糖類結合引發毒性效應，凝集素隨食物進入昆蟲腸道后，就可結合到這些糖蛋白的受體上，阻礙昆蟲的生長發育，甚至殺死昆蟲;MBL還可與微生物表面的甘露糖等糖類結合，干擾其細胞壁的合成，影響其細胞的正常代謝［2-3］。因此，MBL在植物抵御害蟲，病原微生物和植食性動物中起重要作用。已有研究將外源MBL(如雪花蓮MBL)基因導入水稻、煙草、棉花、甘蔗、油菜等［4］作物中，培育出抗蟲新品種。有研究表明，一些植物MBL(如雪花蓮MBL，洋水仙MBL)對人類免疫缺陷病毒和貓免疫缺陷病毒顯示抑制活性［5］。

單子葉植物鐵皮石斛(Dendrobium officinale)為蘭科(Orchidaceae)石斛屬(Dendrobium)植物，《神農本草經》將其列為上品，具有傷中、除痹、下氣、久服厚腸胃等功效。現代醫學研究表明，鐵皮石斛具有抗衰老、抗腫瘤、降低血糖和提高免疫等作用［6］。野生鐵皮石斛生長環境苛刻，加之長期無節制采摘，已是瀕危藥材。基于植物MBL的重要作用，陳中海等［7］克隆了鐵皮石斛甘露糖結合凝集素(Dendrobium officinale mannose-binding lectin，DOL)基因的cDNA序列并推導出其編碼的氨基酸(amino acid，AA)序列。本文在此基礎上對DOL進行同源建模，分子對接和動力學模擬，以進一步研究DOL的結構特征及其與甘露糖的作用機制，為研究鐵皮石斛的藥效及新品種的選育提供信息。

1 材料與方法

1.1 序列分析與同源建模

DOL前體氨基酸序列［7］來源于NCBI GenBank，序列登錄號為AAV66418。DOL與相關MBL的氨基酸序列比對和同源性分析采用DNAMAN［8］完成。DOL同源建模采用的模板為洋水仙MBL［9］(Narcissus pseudonarcissus mannose-binding lectin，NPL)，與DOL的同源一致性為57%，其晶體結構來源于PDB，PDB登錄號為3DZW，通過X射線晶體學解析，分辨率達到 1.7 A。DOL的同源建模采用SWISS-MODEL［10］(http://swissmodel.expasy.org/)的項目模式(Project mode)完成。

1.2 動力學模擬

DOL模型分子動力學(Molecular dynamics，MD)模擬采用 Discovery StudioTM(DS)2.0［11］(Accelrys，San Diego，USA)中基于CHARMm力場的Simulation模塊完成:將整個體系加入5 ? TIP3P水分子，先采用最陡下降法(Steepest descent，SD)進行1 000步能量最小化，收斂標準為0.1 kJ/mol，再用共軛梯度法(Conjugate gradient，CG)進行2 000步能量優化，收斂標準為0.05 J/mol。系統再從50 K進行100 ps加熱到300 K，在300 K進行200 ps平衡。最后在1 atm 300 K條件下以NPT系統進行2 000 ps采樣，選擇保存1 000個構象。蛋白質結構質量檢測采用PROCHECK［12］(http://nihserver.mbi.ucla.edu/SAVS/)和DS Verify Protein(Profiles-3D)工具完成。

1.3 分子對接

由于DOL與NPL具有相同的配體甘露糖，而NPL的復合結構中已含有甘露糖，所以DOL的分子對接配體就采用NPL的配體甘露糖。DOL與配體甘露糖的分子對接采用DS CDOCKER對接模塊完成，對接范圍采用球形，半徑10 ?，其他參數默認。將得到的配體構象進行成簇分析(成簇參數為0.5 ?)，最后依據成簇情況和最低結合能來選取合理的對接結果。對接形成的復合物模型進行動力學分析，模擬參數同DOL模型，對接結果用Ligplot程序分析［13］。

2 結果與分析

2.1 DOL 序列分析

DOL前體(Precursor)氨基酸序列全長165 AA，通過NCBI BLAST以DOL為提交序列搜索蛋白質序列數據庫得到同源性最高的3條MBL前體序列和3條結構已解析的MBL成熟蛋白序列(mat-peptide)，3 條前體序列分別為對葉蘭［14］MBL(Listera ovata mannose-binding lectin，LOL)、生 姜［15］MBL(Zingiber officinale mannose-binding lectin，ZOL)、紅花石蒜［16］MBL(Lycoris radiata mannose-binding lectin，LRL)，GenBank 登 錄號 依次 為 AAC37422、AAV70492、BAD98797，與DOL前體序列的同源一致性分別為53%、50%、49%;3條成熟蛋白序列分別為洋水仙［9］MBL(Narcissus pseudonarcissus mannose-binding lectin，NPL)、雪花蓮［17］MBL(Galanthus nivalis mannose-binding lectin，GNL)、天麻［18］MBL(Gastrodia elata mannose-binding lectin，GEL)、PDB登錄號依次為3DZW、1MSA、1XD5，與DOL的同源一致性分別為57%、54%、47%。

用DNAMAN將DOL與得到的六條序列進行多序列比對(見圖1)。分析結果顯示，DOL同其他三種植物的MBL前體序列一樣均存在信號肽(1-24 AA)，成熟蛋白區域(Maturation peptide region)(25-134 AA)和C端切除肽(135-165 AA)。成熟蛋白區包含3個識別甘露糖所必需的甘露糖結合部位(Mannose-binding domain，MBD)(MBD1:50-58 AA，MBD2:81-89 AA，MBD3:116-124 AA)，構成了一個特征序列QXDXNXVXY。3個保守基序中的甘露糖結合位點為依次為“50、52、54、56、58”，“81、83、85、87、89”，“116、118、120、122、124”。

圖1 DOL與其他6種植物MBL的多序列比對 LOL，ZOL，LRL為前體序列;NPL，GNL，GEL為結構已解析的成熟蛋白Fig.1 The multiple sequence alignment between DOL and six MBLs from different plants LOL，ZOL，LRL are precursor sequences;NPL，GNL，GEL are maturation proteins and their crystal structures were resolved

2.2 DOL 同源建模

根據2.1的分析結果，同源建模采用的DOL序列是DOL成熟蛋白序列(25-134 AA)，選定的模板為NPL成熟蛋白的晶體結構。以NPL為模板用SWISSMODEL構建DOL的三維結構(見圖2)，將DOL與模板NPL結構進行疊合比較，二者的結構具有很高的相似性，其疊合的均方根差(RMSD)為0.77 ?，二者結構均由11個β-折疊區與12個無規則卷曲區構成，除N端一個β-折疊結構只有部分重疊和92-93 AA處產生3個空位以外，其他各區的二級結構基本重疊。DOL的三維結構呈中空的三棱柱結構，棱柱3個側面由β-折疊構成，分別為 sheet 3-6，sheet 2/7-9，sheet 1/10-11。3個MBD分別位于3個側面的coil 5和 sheet5、coil 8 和 sheet 8、coil 11 和 sheet 11。

2.3 DOL模型動力學模擬

為研究DOL模型的穩定性，上述得到的同源模型需要進一步進行動力學模擬。動力學模擬軌跡的均方根偏差(Root mean square，RMSD)是衡量一個體系是否穩定的重要依據，為了檢測動力學軌跡的穩定性，對復合物中DOL骨架原子的均方根偏差進行了分析，如圖3(a)所示，DOL骨架原子的 RMSD在開始階段呈上升趨勢;在大約800 ps之后，軌跡平穩已達到平衡且 RMSD值一直穩定在2.5 ?左右，軌跡略有波動。

圖2 DOL結構和模板NPL結構的疊合Fig.2 The superimposition between the monomer structure of DOL and that of template NPL

此外，在大約1 000 ns的MD模擬之后，體系勢能也趨向最小值而達到穩定。均方根波動(Root mean square fluctuation，RMSF)是反應蛋白質的柔性和穩定性的一個重要參數，如圖3(b)所示，DOL的N端25-125位置的氨基酸RMSF值都在2.0 ?以下，氨基酸比較穩定，只有49、69、82、94略顯波動。DOL的柔性區域主要集中在其C端(125-136)(見圖3(b))，該區主要是無規則卷曲，從三棱柱上延伸出來(見圖2)。

圖3 (a)DOL模型C骨架的RMSD曲線;(b)DOL氨基酸殘基的RMSF曲線Fig.3 (a)The RMSD curve of DOL model backbone;(b)the RMSF curve of DOL residue

2.4 DOL 結構檢驗

DOL結構用PROCHECK進行質量評估，如圖4(a)的Ramachandran圖所示，在參與建模的112個氨基酸殘基中，在允許范圍之內的占96.9%。不合理區的氨基酸殘基Arg95、Leu60、Asp43，這3個殘基均在功能位點之外，不影響后續研究。優化后的DOL進一步用Profiles-3D進行檢測，如圖4(b)的Verify-3D圖所示，98%以上的氨基酸殘基的分值均在0以上，只有C端有兩個氨基酸(Arg135，Phe136)分值在0以下。PROCHECK和Verify-3D結果表明，得到的DOL結構合理，可進一步進行后續研究。

2.5 DOL與配體的分子對接

基于上述分析的活性位點，利用DS Binding Site tools將甘露糖的對接范圍(對接半徑10 ?)定位于3個甘露糖結合部位 (MBD1:50-58AA，MBD2:81-89AA，MBD3:116-124AA)。用 DS從 NPL晶體結構中分離出所需配體甘露糖的三維結構。用DS CDOCKER將甘露糖對接于相應的位置，得到了DOL和甘露糖的復合結構。如圖5所示，3個甘露糖Man1，Man2，Man3 分別作用于 MBD1，MBD2，MBD3三個結合部位，其相互作用能分別為 -64.71 kJ.mol-1、-69.19 kJ.mol-1、-56.5 kJ.mol-1。從相互作用能來看，MBD1，MBD2與甘露糖的結合要強于MBD3(見表1)。

圖4 (a)DOL模型的Ramachandran圖;(b)DOL模型的Verify-3D圖Fig.4 (a)The Ramachandran plot of DOL model;(b)the Verify-3D curve of DOL modelIn

圖5 DOL與甘露糖的復合結構Fig.5 The complex structure of DOL and mannobioses

表1 DOL和甘露糖間的范德華力(Evdw)，靜電作用(Eele)和總的相互作用能(Etotal)Table 1 The van der Waal energy(Evdw)，electrostatic energy(Eele)and Total energy(Etotal)between DOL and Mannobioses

為了研究對接復合物的穩定性，得到的對接模型進行了2 000 ps的動力學模擬。整個復合物的RMSD曲線如圖6所示，復合物在750 ps左右開始趨向于平衡，RMSD值維持在2.2 ?左右，略有波動。與前面的DOL空蛋白的動力學模擬過程相比可知，由于復合物中存在三個配體，使得其RMSD值降低，表明甘露糖與DOL結合可以穩定復合物結構。另外，3個甘露糖 Man1、Man2、Man3的 RMSD最大值分別為 1.12 ?、1.06 ?、1.34 ?，平均 值分別 為0.82 ?、0.80 ?、0.97 ?，說明三者在動力學過程中與DOL結合的很牢靠，沒有脫離DOL結合部位［19］。其中Man3的RMSD值略偏高，說明DOL上的MBD1和MBD2較MBD3更利于甘露糖結合。

在對接的復合物中，3個MBD結構相似，都有一個配體與之結合。甘露糖通過范德華力和氫鍵作用特異性地結合于3個MBD(見圖7)。從圖7(a)、(b)、(c)可以看出，在三組甘露糖結合殘基中與甘露糖直接發生氫鍵作用的都是Gln、Asp、Asn和Tyr，而Val都沒與之發生氫鍵作用。可見在與甘露糖結合的過程中發揮關鍵作用的為Gln、Asp、Asn和Tyr。甘露糖上參與形成氫鍵作用的基團為氧原子。MBD1、MBD2和MBD3與甘露糖的結合都是甘露糖的O分別與Asp、Gln、Tyr、Asn形成氫鍵。甘露糖上MBD1和MBD2與甘露糖的結合方位相似(見圖7(a)、(b))，但是由于結合部位中其它氨基酸的影響，所以氫鍵距離和總的結合能有所區別。

圖6 DOL和甘露糖對接復合物的RMSD曲線Fig.6 The RMSD curve of docking complex of DOL and Mannobioses

圖7 DOL的MBD氨基酸殘基與甘露糖的相互作用Fig.7 The interactions between the MBD residues of DOL and mannobiose

在MBD1(見圖7(a))中，Gln50 NE(2)與甘露糖O4和 O(10)、Asp52 OD(2)與甘露糖 O(10)、Asn54 ND(2)與甘露糖O(10)、Tyr58 OH與甘露糖O(3)形成氫鍵，氫鍵供體原子間距分別為3.24 ?、3.16 ?、2.77 ?、3.13 ?、2.74 ?。 在 MBD2(圖7(b))中，Gln81 NE2與甘露糖O(4)和O(10)、Asp83 OD(2)與甘露糖O(10)、Asn85 ND(2)與甘露糖O(2)和O(10)、Tyr89 OH與甘露糖O(3)形成氫鍵，氫鍵供體原子間距分別為 3.21 ?、2.94 ?、2.54 ?、3.32 ?、3.13 ?、3.32 ?。MBD2 中除了氫鍵，還有Asp105與甘露糖 C1產生靜電作用。在 MBD3(見圖7(b))中，Gln116 NE(2)與甘露糖 O(8)、Asp118 OD(2)與甘露糖O(9)、Asn85 ND(2)與甘露糖O(9)、Tyr124 OH與甘露糖O(3)形成氫鍵，氫鍵供體 原 子 間 距 分 別 為 3.05 ?、2.69 ?、3.05 ?、2.85 ?。綜上，MBD2 由于 Gln81、Asp83、Asn120、Tyr89的氫鍵和Asp105的靜電作用，其與甘露糖的結合要強于MDB1和MBD3，而MBD3與甘露糖的結合較MBD1和MBD2弱。

3 討論

本文分析了DOL前體序列的信號肽(1-24 AA)和C端切除肽(135-165 AA)，獲得了DOL成熟肽(25-134 AA)。通過序列分析得到DOL上的甘露糖結合部位 QXDXNXVXY(50-58 AA，81-89 AA，116-124 AA)。以NPL為同源模板建立了DOL的三維結構模型，DOL呈中空的三棱柱結構，三棱柱的3個側面主要由β折疊構成，3個側面各有一個甘露糖結合基序。根據分析的活性位點確定DOL的配體對接部位，將甘露糖對接進DOL結構中建立了DOL與甘露糖的復合結構。通過分子對接結果和動力學分析表明，結合區50-58 AA和81-89 AA對甘露糖的結合能力要強于116-124 AA，在與甘露糖結合的過程中發揮關鍵作用的氨基酸殘基為Gln、Asp、Asn和Tyr。另外，由于81-89 AA與甘露糖的結合作用最強，因此可以試圖通過點突變的方式，將50-58 AA和116-124 AA突變成81-89 AA的模式，構建突變基因培育轉基因植物，同時也能進一步研究突變蛋白的藥理作用。

單子葉甘露糖結合凝集素(MBL)在農業抗病蟲害上的成功應用引起了人們的廣泛關注，本文DOL的同源建模與分子模擬研究為在分子水平上解釋DOL的功能提供依據，對研究鐵皮石斛抗病毒，抗蟲害有關的基因，通過基因工程等手段獲得鐵皮石斛新品種具有重要意義。另外，已有研究發現MBL對人類或動物逆轉錄病毒具有抑制作用，如雪花蓮凝集素和洋水仙凝集素對人類免疫缺陷病毒和貓免疫缺陷病毒顯示抑制活性［5］，本研究以單子葉植物鐵皮石斛的MBL為研究對象，分析了DOL與甘露糖的作用位點和作用機制，可為凝集素抗病機理及凝集素相關藥物研究奠定基礎。

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