Hsp70核苷酸結合域突變體影響酶活的分子動力學模擬研究

周小紅，徐利楠，薛友林，宋有濤，2*

(1.遼寧大學生命科學院，遼寧沈陽110036;2.遼寧大學環境學院，遼寧沈陽110036;3.遼寧大學輕型產業學院，遼寧沈陽110036)

Hsp70家族是細胞內一類高度保守的分子伴侶蛋白，可以與其它分子伴侶共同參與多種重要的生命活動，如非天然多肽的折疊、多聚體的組裝、細胞器蛋白的轉運及錯誤折疊蛋白的降解等［1］。所有的Hsp70家族都由一個氮端44 kDa的核苷酸結合域(NBD，包括 NBD-I，NBD-II)和一個碳端25 kDa的底物結合域(SBD，Substrate-binding domain，包括SBD-α，SBD-β)組成［2］。

此前，McKay等人的研究發現牛Hsc70(Heat shock cognate 70 protein)的ATP酶活性與金屬離子及活性位點 T13、T204的自身磷酸化有重要關系［3］，其中，T13側鏈的羥基對 ATP酶活性具有重要作用［4］。此外，Chiappori等人研究指出，loop1的柔性對ATP酶活性具有重要作用，柔性越強ATP酶活性越高［5］。這些結果暗示著loop1的構象改變可能引起Hsp70氮端ATP酶活的變化。隨后，Jones等人的研究指出酵母Hsp70氮端NBD存在大量影響ATP酶活性的位點［6-7］，Chang等人在 DnaK(大腸桿菌Hsp70)中得出相同結果［8］。但是，Jones和Chang等人都沒有從分子水平去探討loop1的構象改變和ATP酶活的關系。

為了從分子水平上探討loop1構象的改變與ATP酶活的關系，在已有研究表明同源的突變體功能相似的基礎上［9］，我們選用同源性很高的DnaK進行動力學模擬(酵母Hsp70晶體結構未知)，研究了點突變可能通過loop1的構象改變而引起ATP酶活變化——酵母 Hsp70氮端 NBD中 A17V(DnaKA17V)、R23H(DnaKT23H)、G32S(DnaKG32S)增強ATP酶活、R167H(DnaKR167H)對 ATP酶活無影響［6］。該研究不僅是對Jones等人生化試驗數據的分子解釋，而且對后續Hsp70氮端NBD的點突變研究具有重要的借鑒意義。

1 實驗過程

1.1 蛋白質的來源及模型構建

酵母Hsp70氮端NBD初始三維結構模型來自同源蛋白 E.coli DnaK(RCSB數據庫，PDB編號1DKG:D)［10］。將已知的野生型DnaK NBD晶體結構模型與對應的17位、23位、32位、167位突變體一級序列提交至 Swiss Model服務器上(http://swissmodel.Expasy.org)［11］，根據同源建模算法得到所有突變型蛋白的三維結構，將該模型作為后續動力學模擬突變型A17V、R23H、G32S、R167H NBD的初始模型。

1.2 動力學模擬過程

本模擬利用由動力學模擬軟件Gromacs 4.5.5［12］和三維結構分析軟件 PyMOL 進行。各模型的模擬步驟及參數設定均相同。具體步驟及參數如下:

(1)力場選擇:根據不同力場偏向于不同的結構狀態模擬，該模擬各體系均采用NPT系綜，計算力場選用GROMOS96 43a1。

(2)溶解蛋白:將結構模型放進一個立方體的周期性邊界盒子中并置于該盒子的中心，設定模型中任一原子距盒子邊緣的距離大于1.0 nm，以保證其不會和另一個盒子中的鏡像相互作用。水溶液環境采用SPC模型水分子(約含25 169個水分子)。

(3)平衡電荷:正常的生理條件下，體系的pH值應接近中性，總電荷為0。向各溶液體系中加入不同數量的Na+或Cl-，保持體系 pH=7，總電荷為0。

(4)能量最小化:為了消除可能的原子碰撞，根據蛋白質折疊的熱力學，先將各模型在真空中以最陡下降法(steep)優化2 000步的能量使其達到結構穩定狀態。

(5)限制性模擬:根據固定主鏈，優化側鏈的原則，為了使側鏈找到一個較穩定的狀態避免出現溶劑分子分布不均的問題，進行了80 ps的限制性模擬。

(6)最終的動力學模擬:達到上述平衡之后，各體系在恒定的溫度和壓力下進行10 ns的分子動力學模擬。分子的運動軌跡每4 ps收集一次，以便用于后續的數據分析。

此外，為了保持整個模擬過程中體系溫度穩定在300 K、壓力穩定在 1.0×105Pa，分別采用“V-rescale”和“Parrinello-Rahman”方法對體系溫度和壓力進行控制，耦合常數分別為0.1 ps和0.5 ps。模擬的時間積分步長為2fs，整個體系使用周期性邊界條件，采用LINCS(linear constraint solver)算法對體系中所有鍵的鍵長進行約束，靜電相互作用采用PME(particle mesh Ewald)算法進行估算，截斷半徑為1.0 nm。范德華力通過“cut-off”方法進行估算，截斷半徑為1.0 nm。

2 結果與討論

2.1 結構穩定性

RMSD(Root mean square deviation，均方根偏差)可用來測量進行比對的兩個蛋白質相同位點的氨基酸殘基碳原子之間的距離，是衡量模擬過程中蛋白質穩定程度的重要參數，間接反應蛋白質靈活性。通過比較整體RMSD曲線的變化趨勢得出在7 ns時各模型均達到平衡狀態(見圖1a)，結構穩定。對loop1穩定性分析發現，各模型在7 ns時達到平衡(見圖1b)，平均值分別為:WT(0.51 nm)、R167H(0.69 nm)、G32S(0.81 nm)、A17V(0.84 nm)、T23H(0.75 nm)。從這些數據可以明顯看出突變模型A17V、T23H、G32S中loop1的RMSD平均值均比WT、R167H高。表明突變模型 A17V、T23H、G32S的柔性比 WT、R167H 強，暗示 A17、T23、G32三個位點可能通過loop1構象變化，引起酵母Hsp70氮端NBD的ATP酶活性變化。

圖1 (a)蛋白RMSD隨時間變化(b)loop1RMSD隨時間變化Fig.1 (a)The protein RMSD as a function of simulation time(b)The loop1 RMSD as a function of simulation time

2.2 Hsp70氮端ATP酶活性區域結構對比

通過三維可視軟件PyMOL，標示出loop1和重要殘基T11在E.coli DnaK氮端NBD的位置(見圖2)。

圖2 DnaK NBD三維結構Fig.2 DnaK NBD three-dimensional structural

為進一步分析loop1怎樣的構象改變而引起Hsp70氮端NBD的ATP酶活性變化，我們對A17V、T23H、G32S、R167H、WT 進行了 10 ns時整體蛋白三維結構對比分析。結果顯示，突變模型R167H與WT在loop1處具有相似的構象，重要殘基T11側鏈未向內發生移動(見圖 3a)。突變模型 A17V、T23H、G32S與WT結構對比發現，T11的側鏈均向內發生不同程度移動(見圖3b，圖c，圖d)，預示著在酵母Hsp70 ATP水解過程中，A17V、T23H、G32S三個突變模型與WT和R167H相比能夠更快速的通過T11側鏈的羥基與ATP進行相互作用，攻擊ATPγ-磷酸基團，引起 ATP快速水解，從而增強ATP酶活性。

圖3 模擬后loop1結構對比:WT(T11:Sticks)(a)R167H(T11:lines)(b)A17V(T11:lines)(c)T23H(T11:lines)(d)G32S(T11:lines)Fig.3 loop1 structural alignment after MD simulation:WT(T11:Sticks)(a)R167H(T11:lines)(b)A17V(T11:lines)(c)T23H(T11:lines)(d)G32S(T11:lines)

2.3 Hsp70 ATP酶活性區域距離分析

為了深入探討前面提到的構象改變與功能變化關系，我們引入了一個ATP分子(RCSB數據庫，PDB編號:3LDL)進行距離分析。McKay等人研究指出，Hsc70 T13(DnaKT11)殘基對ATP水解的重要作用，是通過T13側鏈的羥基對ATPγ-磷酸基團作用，引起ATP酶水解速率變化［5］。數據顯示，10 ns時T11側鏈的羥基與γ-磷酸基團距離(見圖4a，b，c，d，e)WT(5.5 ?)，R167H(6.0 ?)均大于突變模型 A17V(1.3 ?)、T23H(4.9 ?) 和 G32S(4.6 ?)。數據表明，T11側鏈的羥基與γ-磷酸基團距離變近，其相互作用增強，可能引起ATP酶活性增強，與前面結論相一致。從分子水平初步解釋了生化試驗酵母Hsp70 A17V，R23H，G32S點突變增強ATP酶活結論。

2.4 loop1 氫鍵分析

為了探討引起loop1發生向內移動的原因，我們對loop1與周圍氨基酸的氫鍵交互作用進行了分析，通過計算得到各突變體模型10ns模擬過程中氫鍵數量的平均值分別為:WT(1.2個)、R167H(1.2個)、A17V(2.6 個)、T23H(2.4 個)、G32S(0.4個)。結果表明，A17V、T23H突變體模型在10ns模擬過程中的氫鍵數量顯著高于WT、R167H，然而有趣的是G32S突變體模型在10ns模擬過程中的氫鍵數量低于WT、R167H(見圖5a)。隨后氫鍵存活時間分析發現(見圖5b)，在10ns模擬過程中穩定氫鍵數量分別為WT(1個)、R167H(1個)、A17V(3個)、T23H(3個)、G32S(1個)。以上數據表明A17V、T23H點突變后，引起loop1中與T12相互作用的氫鍵數量顯著增加，增強了loop1附近的氫鍵網絡，從而間接調控loop1中T11側鏈向內移動，引起ATP酶活性的增強;值得注意的是，G32S點突變后盡管減少了loop1氫鍵數量，但是氫鍵存活時間表明，在沒有與T12相互作用的氫鍵存在時，每隔一段時間會重復出現T11-S38氫鍵，有規律的影響T11殘基的狀態，可能直接引起T11側鏈向內移動，從而增強ATP酶活性。

圖4 模擬后T11殘基與γPi距離(單位:?)(a)WT(b)R167H(c)A17V(d)T23H(e)G32SFig.4 the distance of T11 and γPi after MD simulation(?)(a)WT(b)R167H(c)A17V(d)T23H(e)G32S

圖5 (a)模擬過程中loop1氫鍵數量(b)模擬過程中loop1氫鍵存活時間Fig.5 (a)the number of hydrogen bond during the MD simulation(b)Hydrogen bond existence map of loop1 during the MD simulation

3 結論

Hsp70分子伴侶SBD和NBD的功能既相互聯系又相互獨立，分析其中一個結構域的構象功能變化，能夠間接反應出整個Hsp70分子伴侶的功能變化。在本研究中，A17V，T23H，G32S點突變引起Hsp70氮端NBD ATP酶活性區域的ATP結合口袋袋口Loop1柔性增強，重要殘基T11側鏈向內移動，接近ATPγ-磷酸基團，增強其與ATP的作用，提高ATP水解速率，從而增強ATP酶活性，引起Hsp70分子伴侶功能變化。

本研究為我們從分子水平上解釋Jones等人的生化試驗結果(A17V，R23H和G32S點增強ATP酶活，R167H與WT對 ATP酶活沒有影響［6］)提供了數據支持。同時也從分子水平對 Hsc70 T13(DnaKT11)側鏈的羥基對ATP酶具有重要作用［4］進行了一定驗證，對后續Hsp70氮端NBD的突變研究具有重要的借鑒意義。

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