緩激肽對高糖誘導腎系膜細胞JNK通路活化的影響

李 妍 杭州師范學院醫學院附屬余杭醫院 杭州 311100

趙久陽 大連醫科大學附屬二院

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是一類以進行性腎臟纖維化為特征的疾病。激肽系統（kallikrein-kinin system，KKS）對于腎小球硬化和腎間質纖維化具有明顯的抑制作用[1-2]，而緩激肽（braykinin，BK）是該系統發揮效應的最終作用因子。本實驗采用高糖刺激腎系膜細胞，使細胞達到預增殖狀態，以磷酸化JNK 蛋白表達量代表JNK 通路的活化程度，研究BK 對高糖誘導的細胞磷酸化JNK蛋白表達的影響，深入了解BK 對糖尿病腎病腎纖維化的保護作用的機制，為臨床防治提供依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 BK（美國Calbiochem），BK 受體阻斷劑HOE-140（美國Sigma），RPMI 1640 培養液（美國GIBCO），D-Glu（美國Sigma），SP 600125（美國Santa Cruz），小鼠抗人P-JNK 一抗（美國Santa Cruz），辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠Ig-G 二抗（大連晨玉），胎牛血清（FBS）（天津中科院TBD），醋酸纖維素膜（NC 膜）（美國Bioshop）。

1.2 細胞培養及分組方法 細胞來源：永生代成年大鼠腎小球系膜細胞系購自美國Cambrex。細胞培養：于含10%胎牛血清（FCS）的RPMI1640 培養液、5%CO2、37℃的孵箱中傳代培養，生長至80%融合時，饑餓培養24h，使細胞同步于G0 期，隨后依實驗目的不同分成不同試驗組。

實驗分組：按培養液中刺激因素不同分組，每組均為含10%滅活胎牛血清的RPMI1640 培養液。細胞分組：①對照組：培養液中測定其葡萄糖濃度為5mmol/L。②高糖組：培養液中測定其葡萄糖濃度為30mmol/L。③緩激肽+高糖組：培養液中緩激肽濃度（100ng/mL）預孵15min 后，加入葡萄糖濃度30mmol/L。④緩激肽B2 受體阻斷劑＋緩激肽+高糖組：培養液HOE-140（1μmol/L）預孵15min 后，加入緩激肽100ng/mL 預孵15min，再加入葡萄糖濃度30mmol/L。⑤JNK 通路阻斷劑＋緩激肽+高糖組：SP-600125（10μmol/L）預孵15min 后，再加入緩激肽100ng/mL預孵15min 后，再加入葡萄糖濃度30mmol/L。

1.3 免疫印跡（Western－blotting）法檢測JNK 信號通路的激活 依據分組不同，將細胞接種在10cm 的培養皿中，生長至80%融合的系膜細胞用無血清培養基培養24h，然后吸出培養基，換用新的無血清培養基，并根據分組加入不同的作用因子，并用含有1mmol/L 釩酸鈉（NaVO4）的冰冷的PBS 沖洗三次終止反應，加入蛋白裂解液（預冷）刮下細胞轉移至EP管中，超聲粉碎后12 000rpm 4℃離心20min 取上清。上述操作均于冰上進行，以避免蛋白降解。蛋白濃度以Bradford 分析法確定。取5μL 樣品，加入95μL 雙蒸水，再加入3mL Bradford 顯色液后立即混勻。用紫外分光光度儀在595nm 下測定OD 值，作雙管重復測定結果，通過標準曲線計算樣品蛋白濃度。取樣品行SDS-PAGE 電泳，90V 恒壓轉膜2h，用5%牛血清封閉過夜。封閉后的膜與單克隆小鼠抗人磷酸化JNK（Ⅰ抗）4℃雜交孵育1h，再與辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠IgG 抗體（Ⅱ抗）室溫孵育雜交1h。抗體均用抗體緩沖液適當稀釋，雜交時輕搖抗體使之與膜均勻、充分接觸，每次雜交完畢均用TTBS洗去殘余未結合抗體。將硝酸纖維素膜浸于DAB 顯色液中，于暗處觀察，觀察有清晰的特異條帶出現時，用大量的水沖洗硝酸纖維素膜以終止顯色反應。定影，拍照。凝膠掃描分析系統（2020D，美國Kodak）軟件行圖象掃描及條帶吸光度半定量分析，為消除掃描和分析中的誤差，重復三次該過程，并取均值作統計學分析。

1.4 統計學方法 應用SPSS13.0 軟件分析數據，數據用均值±標準差（）表示，采用單因素方差分析，P＜0.05 認為差異有統計學意義。

2 結果

對照組表達一定基礎水平的磷酸化JNK 蛋白，高糖組較對照組磷酸化JNK 蛋白的表達量增多，差異有統計學意義（P＜0.05）；BK 加高糖組的磷酸化JNK 的表達量與高糖組比較明顯減少（P＜0.01），與對照組比差異無統計學意義（P＞0.05）；加入BK-B2 受體阻斷劑后，與不加阻斷劑組比磷酸化JNK 蛋白的表達量增多（P＜0.05），但仍顯著低于高糖組，差異有統計學（P＜0.05）；使用JNK 通路阻斷劑后，JNK 磷酸化蛋白表達量明顯減少，有統計學差異（P＜0.01），見圖1，圖2。

圖1 各組總磷酸化JNK 蛋白表達量

圖2 磷酸化JNK 蛋白電泳圖（P-JNK 包括P-JNK1和P-JNK2）

3 討論

糖尿病腎病是一類以進行性腎臟纖維化為特征的疾病。在腎小球的各種類型細胞中,系膜細胞是受高血糖影響最顯著的細胞。C-Jun 氨基末端激酶（CJunNH2-terminal kinase，JNK）為絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinases，MAPKs）通路成員之一，是細胞內的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是將胞外刺激信號傳遞給胞核的主要傳導通路。JNK可被應激反應如滲透壓的改變、熱休克、炎癥反應因子IL-1α、INF－α、DNA 損傷等因素所激活。體內研究發現，JNK 在腎損傷的早期發揮重要作用[3]。因此,我們選用系膜細胞作為研究對象來研究BK 對高糖誘導系膜細胞表達磷酸化JNK 蛋白的影響，探索BK延緩糖尿病腎病腎小球硬化的機制。

近年來發現激肽釋放酶－激肽系統（kallikreinkinin system，KKS）對細胞的生長、細胞外基質的合成及降解起著重要的調節作用。BK 的生理作用主要由B2 受體（BKB2R）介導，B1 受體（BKB1R）在生理情況下不表達，可能在炎癥、缺血或組織損傷等情況下放大BKB2R 介導的效應。

研究發現，BK 的作用與MAPK 通路關系密切，而目前研究比較清楚的是BK 對ERK 通路的影響。實驗表明，BK 可以調節ERK 的激活，BK 通過抑制ERK 的激活可以調節增殖狀態系膜細胞的增殖[4-5]。而BK 對JNK 通路影響的文獻卻很少。

Liu 等[6]報道，BK 可促進鼠的成纖維細胞JNK磷酸化蛋白的表達，即BK 可以調節JNK 通路的激活。關于BK 對系膜細胞JNK 磷酸化蛋白的影響，目前國內很少報道，研究發現BK 對系膜細胞的調節具有雙向性[4，7]，即作用于靜止狀態的系膜細胞引起其增殖，而作用于增殖狀態下的系膜細胞時起抑制增殖的作用。本實驗用高糖刺激系膜細胞，使其處于增殖狀態，使用B2 受體阻斷劑、JNK 通路阻斷劑（SP600125）后，通過檢測磷酸化JNK 蛋白表達量的變化，觀察BK 對高糖誘導系膜細胞表達JNK 磷酸化蛋白的影響。結果顯示，高糖組表達JNK 磷酸化蛋白明顯高于對照組，而BK 可以抑制高糖誘導細胞的JNK 磷酸化水平，BK-B2 受體阻斷劑可以阻斷BK的抑制作用，使磷酸化JNK 蛋白表達量增多，說明BK 通過B2 受體抑制高糖誘導的JNK 磷酸化蛋白的表達。而加用JNK 阻斷劑可完全阻斷這條通路的激活，磷酸化JNK 蛋白表達明顯減少，且低于對照組水平（P＜0.01）。本研究發現BK 可抑制高糖誘導系膜細胞的磷酸化JNK 蛋白的表達。推測BK 抑制DN時的腎纖維化的作用可能是通過調節磷酸化JNK 蛋白的表達實現的。

Makkinje 等[8]研究顯示，JNK 通路在DN 的持續發展過程中發揮作用。Ingram 等[9]發現，高糖（30mmol/L）的機械牽張（14kPa）可以激活體外培養的大鼠系膜細胞的JNK 通路，而P38MAPK 和ERK 活性變化不明顯。相關研究報道高糖環境下導致的氧化應激狀態，激活JNK/SAPK 途徑，刺激系膜細胞CTGF、FN的合成，導致細胞外基質的積聚，最終導致腎小球硬化。而本實驗顯示，BK 可以調節JNK 通路的激活從而發揮抑制糖尿病腎病進展的作用。

轉錄因子AP-1 是細胞內JNK/SAPK 作用的重要目標，JNK 通路被激活后，可以通過轉錄因子AP-1 將細胞外刺激信號傳導至細胞核，激活AP-1 位點的靶基因轉錄。核內立早基因c-fos、c-jun 編碼的蛋白產物分別形成了Fos 家族（c-Fos、FosB、Foral、Fraz）蛋白和Jun 家族（c-Jun、JunB、Jun 與Fos）二聚體，構成轉錄因子AP-1。已知單核細胞趨化蛋白－1、轉化生長因子-β、纖維連接蛋白（FN）、層粘連蛋白B 及細胞周期素D1 等基因啟動子中均存在與AP-1 結合的作用元件（TRE 元件）。故BK 可能是通過JNK/SAPK/AP-1 途徑調節轉化生長因子－β、纖維連接蛋白（FN）等基因啟動子的結合而發揮抑制腎纖維化作用。

綜上所述，BK 作為一種細胞因子，可通過調節JNK 磷酸化蛋白表達，來調節JNK 通路的活性，從而在延緩糖尿病腎病腎小球硬化的進程中發揮重要的作用。

［1］Wolf WC，Yoshida H，Agata J，et al.Human tissue kallikrein gene delivery attenuates hypertension,renal injury,and cardiac remodeling in chronic renal failure［J］.Kidney Int，2000，58（2）：730-739.

［2］Schanstra JP，Neau E，Drogoz P，et al.In vivo bradykinin B2 receptor activation reduces renal fibrosis［J］.J Clin Invest，2002，110（3）：371-379.

［3］Hamaguchi A，Kim S，Yano M，et al.Activation of glomerular initogen-activated protein klnases in angiotensin II-mediated hypertension［J］.J Am Soc Nephrol，1998，9（3）：372-380.

［4］Celine Alric，Christiane Pechet，Eric Cellier，et al.Inhibition of IGF-1-induced Erk1 and 2 activation and mitogenesis in mesangial cells bybradykinin［J］.Kidney International，2002，62：412-421.

［5］Eric Cellier，Marilyne Mage，Johan Duchene，et al.Bradykinin reduces growth factor-induced glomerular ERK1/2 phosphorylation［J］.AmJ Physiol Renal Physiol，2003，284：282-292.

［6］Liu B，Yu J.Microarray and phosphokinase screenings leading to studies on ERK and JNK regulation of connective tissue growth factor expression by angiotensin II 1a and bradykinin B2 receptors in Rat1 fibroblasts［J］.J Cell Biochem，2006，97（5）：1104-1120.

［7］Alric C，Pecher C，Schanstra JP，et al.Bradykinin-induced inhibition of cell proliferation and tyrosine kinase activity in rat mesangial cells［J］.Int MolMed，2000，5（1）：85-93.

［8］Makkinje A，Quinn DA，Chert A，et al.Cene 33/mig-6,atranscriptionally induci-ble adapter protein that binds GTPCDC42 and activates SAPK/JNK.A potential marker transcript for chronic pathologic conditions,such as diabetic nephropathy.possible role in the response to persistent stress［J］.J Biol Chem，2000，275（23）：17838-17847.

［9］Ingram JA，Ly H，Thai K，et al.Mesangial cell signailing cascades in response to mechamical strain and glucose［J］.Kidney Int，1999，56：1721-1728.