參麥注射液對膿毒癥模型大鼠腎臟細胞凋亡和Bcl-2/Bax 蛋白表達的影響

林梅瑟 葉 帆 浙江省溫州市中醫院ICU 溫州 325000

趙志光 溫州醫學院附屬第二醫院病理科

膿毒癥是由感染所致的全身炎癥反應綜合征，是危重患者主要的死亡原因，也是重癥醫學面臨的主要焦點和難點。一項多中心大樣本的回顧性研究顯示，42.1%的膿毒癥患者并發急性腎損傷（acute kidney injure，AKI），膿毒性AKI 患者病情更危重、病死率更高；膿毒性AKI 是高病死率及長住院時間的獨立影響因素[1]。參麥注射液在臨床上廣泛應用于危重病患者的救治，有報道參麥注射液對膿毒癥患者的肝、腎、心功能有保護作用[2]。本研究采用盲腸結扎穿刺法（cecal ligation puncture，CLP）制備大鼠膿毒癥模型，觀察參麥注射液對膿毒癥大鼠腎臟細胞凋亡影響，現報道如下。

1 實驗材料

1.1 動 物 健康清潔級雄性Sprague-Dawley 大鼠45 只，體質量280～350g，由溫州醫學院動物實驗中心提供，動物合格證號SYXK（浙）2005-0061。

1.2 藥物和試劑 參麥注射液（規格：10mL/支，批號1110201，正大青春寶藥業有限公司）；Bcl-2、Bax 免疫組化試劑盒（批號MAB-0014、MAB-0254，福州邁新生物技術有限公司）；二抗為抗鼠IgG 聚合物；DAB 試劑盒（批號12120743F，福州邁新生物技術有限公司）；大鼠腎臟細胞凋亡試劑盒（批號DMK500，寶生物工程大連有限公司）。

2 實驗方法

2.1 模型制備及分組 45 只大鼠隨機分為假手術組、膿毒癥模型組和參麥組，每組15 只。采用盲腸結扎穿刺法（CLP）造模：大鼠術前在標準飼養條件下適應1 周，腹腔內注射10%水合氯醛麻醉（3.5mL/kg），腹壁正中切開2cm，拉出盲腸后在盲腸總長度50%處結扎，用針頭在結扎線下5mm 處貫穿盲腸1 次，造成2 個漏口，回納盲腸后關腹。假手術組除不結扎和穿刺盲腸外，其余操作同膿毒癥模型組。膿毒癥模型組CLP 造模前1h 腹腔內注射生理鹽水10mL/kg，參麥組CLP 造模前1h 腹腔內注射參麥注射液10mL/kg。三組大鼠術后立即皮下注射50mL/kg 林格氏液抗休克治療。

2.2 標本采集 于術后24h 予10%水合氯醛（3mL/kg）腹腔內注射麻醉大鼠，打開腹腔，分離腎臟，將一個腎臟組織迅速放入10%甲醛溶液中固定，送病理室切片做玻片制備，另一腎臟組織迅速置于冷凍管中，液氮保存待用。

2.3 腎臟細胞凋亡檢測 采用末端脫氧核糖核苷酸轉移酶介導的dUTP 缺口末端標記法（TUNEL 法）檢測腎臟細胞凋亡。嚴格按試劑盒操作：將石蠟切片脫蠟，梯度乙醇水化；蛋白激酶K 消化后PBS 沖洗；過氧化氫阻斷后PBS 沖洗；TUNEL 反應液37℃60min后PBS 沖洗；DAB/H2O2顯色；蘇木素復染；脫水、透明、封片。正常腎臟細胞核呈藍色，而凋亡陽性腎臟細胞核呈棕黃色。每張切片在光學顯微鏡200 倍視野下分別隨機選擇10 個區域，每個區域計數100 個細胞，計算腎臟細胞凋亡指數（apoptosis index，AI），其公式為AI=凋亡細胞數/總觀察細胞數×100%。

2.4 腎臟細胞Bcl-2 與Bax 蛋白表達 采用免疫組化檢測。腎臟標本用10%中性甲醛固定24h 后行常規石蠟包埋、切片，貼附于涂有多聚氨酸的載玻片上，二甲苯和乙醇脫蠟。切片脫蠟后阻斷內源性過氧化物酶，修復抗原，以羊血清工作液封閉,室溫孵育10min，然后分別加入Bcl-2 與Bax 抗體，生物素標記二抗，DAB 顯色，蘇木精復染，脫水、透明、封固，光鏡下觀察。細胞漿中有棕黃色顆粒者為Bcl-2、Bax蛋白陽性表達細胞。每張切片在光學顯微鏡200 倍視野下分別隨機選擇10 個區域,每個區域計數100個細胞，計算Bcl-2、Bax 蛋白陽性表達細胞百分比。

2.5 統計學方法 應用SPSS11.5 統計軟件處理數據。計量資料用均數±標準差（）表示，組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）；凋亡指數及Bcl-2 與Bax 采用非參數成組設計多個樣本比較的秩和檢驗（Kruskal-Wallis H 法），組間兩兩比較用Mann-Whitney U 檢驗。計數資料用率或頻數表示，采用χ2檢驗。

3 實驗結果

3.1 三組大鼠體質量比較 造模型時膿毒癥模型組死亡6 只，參麥組死亡4 只，假手術組無死亡。三組大鼠體質量比較差異無統計學意義（F=0.187，P=0.829），見表1。

表1 三組大鼠體質量比較（） kg

表1 三組大鼠體質量比較（） kg

3.2 大鼠腎臟細胞凋亡 三組均可見腎臟細胞凋亡，細胞凋亡多發生于腎小球細胞。膿毒癥組和參麥組腎臟細胞AI 均高于假手術組（P＜0.01），參麥組腎臟細胞AI 雖低于膿毒癥組，但差異無統計學意義（P=0.084），見表2。

3.3 大鼠腎臟Bcl-2 和Bax 蛋白表達 免疫組化結果顯示，與假手術組比較，膿毒癥組和參麥組腎臟細胞Bcl-2 表達下降（P＜0.01，P＜0.05），Bax 表達上調（P＜0.01），Bcl-2/Bax 比值減小（P＜0.01）。與膿毒癥組比較，參麥組Bcl-2 明顯上調（P＜0.01），Bax 表達下調（P＜0.05），Bcl-2/Bax 比值增大（P＜0.01），見表2。

表2 三組大鼠腎臟細胞AI、Bcl-2和Bax 表達量比較（） %

表2 三組大鼠腎臟細胞AI、Bcl-2和Bax 表達量比較（） %

注：與假手術組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與膿毒癥組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

4 討論

膿毒癥細胞存在多條細胞凋亡的信號途徑，其中線粒體途徑是其最重要的途徑之一[3]。Bcl-2 和Bax蛋白是該途徑的重要調節因子，而Bax 蛋白具有促進凋亡作用，Bcl-2 蛋白起抑制凋亡的作用。

膿毒癥是ICU 患者發生ARF 最常見的原因，其發病機制復雜，目前比較關注的是細胞凋亡在膿毒癥腎損害中的作用。國內學者研究CLP 膿毒癥大鼠發現，膿毒癥出現后大鼠腎功能損壞、腎小管上皮細胞凋亡，免疫組化檢測Bax 蛋白表達上升，Bcl-2/Bax下降[5]。另有研究發現增加Bcl-2 表達、抑制Bax 表達，上調bcl-2/Bax 比值，可以減少細胞凋亡[6-7]。因此，抗凋亡措施可能對膿毒癥腎功能起保護作用。新近在對軟骨細胞研究顯示參麥注射液可能通過降低促凋亡基因BaxmRNA 表達，增加凋亡抑制基因Bcl-2mRNA 的表達，從而調節Bcl-2/BaxmRNA 的比例，抑制凋亡[8]。

參麥注射液是人參與麥冬制成的中藥制劑，其有效成分為人參皂苷、麥冬皂苷、麥冬黃酮及微量人參多糖和麥冬多糖，具有養陰生津、補心復脈、益氣固脫之功效，是目前對休克、心衰等急癥常用的中藥急救制劑。研究[9]發現，參麥注射液使脂多糖致膿毒癥大鼠的血清TNF-α 水平下降，肝、腎、肺組織SOD活性增強，肝、腎功能得到保護。在CLP 模型膿毒癥大鼠研究發現參麥注射液可顯著降低膿毒癥大鼠血清促炎性遞質和CRP 水平，對膿毒癥具有保護作用。俞興群等[10]研究顯示，參麥注射液能顯著降低全身炎癥反應綜合征（SIRS）氣虛血瘀證患者的C-反應蛋白、腫瘤壞死因子-α 和白細胞介素（IL-1β、IL-6、IL-8）水平，有效阻止SIRS 的發展與惡化。參麥注射液對膿毒癥腎臟細胞凋亡抑制作用未見相關報道。本研究顯示，參麥注射液可以顯著上調膿毒癥大鼠腎臟細胞Bcl-2 蛋白表達、下調Bax 蛋白表達，從而對凋亡基因起調控作用。雖然注射參麥與生理鹽水的膿毒癥大鼠腎臟凋亡指數比較差異無統計學意義（P=0.084），但參麥組凋亡指數已呈下降趨勢。由于本研究實驗動物數量有限，有待擴大樣本進一步明確參麥注射液對膿毒癥大鼠腎臟細胞凋亡抑制作用。

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