C75對肝癌細胞侵襲轉移的影響及其機制

王益東，陳昆侖，朱海濤，劉仲偉，劉 妮，徐 心(西安交通大學醫學院第二附屬醫院普通外科，西安70004;西安交通大學醫學院;通訊作者，E-mail:xuxin77@6.com)

肝癌在亞洲和非洲發病率較高，同時由于缺乏針對肝癌侵襲轉移的有效治療手段，病死率居高不下［1，2］。腫瘤的侵襲轉移是一個多基因、多因素共同調控的復雜過程，其中基質金屬蛋白酶及其抑制劑等多種因素在其中發揮重要作用［3］，但具體機制尚未完全明了，有待進一步深入研究。

脂肪酸合成酶(FAS)是脂肪酸合成過程中的關鍵酶，在多種腫瘤中均存在FAS異常高表達和內生性脂肪酸的活躍代謝，包括乳腺癌、前列腺癌、結腸癌和肝癌等［4－9］。FAS與腫瘤的發生發展密切相關，許多研究便以其為靶點研發抗腫瘤藥物，C75便是多種FAS抑制劑中的一種。C75是一種化學合成的穩定的FAS抑制劑，研究發現該藥能夠抑制多種腫瘤細胞的增殖［10－17］。但關于其抑制腫瘤細胞侵襲轉移的作用鮮有報道。基質金屬蛋白酶2(MMP-2)和基質金屬蛋白酶9(MMP-9)在腫瘤細胞的侵襲轉移過程中發揮重要作用，其能夠降解細胞外基質，以利于腫瘤細胞的遷徙和侵襲［3］。而基質金屬蛋白酶抑制劑(TIMP)能夠與抑制MMP的活性，從而對腫瘤細胞的侵襲轉移發揮抑制作用［3］。本研究中，我們對C75對肝癌MHCC97H細胞侵襲轉移的作用做了研究，擬初步闡明C75在肝癌細胞侵襲轉移過程中的作用。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

MMP-2，MMP-9，TIMP-1 和 TIMP-2 蛋白抗體(Cell Signal，美國)，β-actin 單抗(santa cruz，美國)，ECL化學發光試劑盒(Pierce，美國)，DMEM培養基，胎牛血清(Hyclone，美國)，C75(SIGMA，美國)，其他試劑均為國產分析純。

1.2實驗方法

1.2.1 細胞培養及C75對MHCC97H細胞增殖能力的檢測 MHCC97H細胞(西安交通大學醫學院楊成成博士饋贈)用含10%胎牛血清的DMEM培養液，于5%CO2培養箱中，37℃常規培養。融合率達到70%－80%進行傳代培養。MTT法檢測不同濃度 C75(0，2.5，5，10，20 μg/ml)對 MHCC97H 細胞增殖能力的影響。

1.2.2 劃痕實驗檢測C75對細胞遷徙能力的影響接種MHCC97H細胞于6孔板中，當細胞融合率達到70%－80%時，采用1 μl白槍頭在六孔板中平行劃痕，PBS沖洗脫落細胞，鏡下觀察劃痕是否良好，細胞分為空白對照組(DMSO)、2.5 μg/ml和 5 μg/ml組。分別于 0，6，12，24 h 時對劃痕進行照相，并對劃痕圖片進行分析，檢測C75對細胞遷徙能力的影響。

1.2.3 Transwell小室法檢測細胞的侵襲能力 將基質膠均勻涂于 Transwell小室(BD，美國)底部。取對數生長期MHCC97H細胞，用無血清的培養基制備單細胞懸液，上室中加入1×105個細胞(體積200 μl)，下室中加入 500 μl血清濃度為 10% 的完全培養基。分組情況同1.2.2，24 h后取出小室，并進行清洗(PBS)，固定(4%多聚甲醛)，染色(結晶紫溶液)和計數。計數前用棉簽輕輕擦掉上室中未穿過細胞。

1.2.4 Western blot檢測 MMP-2，MMP-9，TIMP-1 和TIMP-2的蛋白表達 取對數生長期MHCC97H細胞，蛋白裂解液冰上裂解30 min，14 000 r/min離心15 min，取上清，采用BCA法測蛋白濃度后煮沸變性(5 min)。SDS-PAGE電泳法電泳，濕法轉膜后將膜置于5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗(MMP-2 1∶1 000、MMP-9 1∶1 000、TIMP-1 1∶1 000、TIMP-2 1∶1 000、βactin 1∶1 000)4℃孵育過夜，TBST充分洗膜，相應二抗室溫孵育1 h，凝膠成像分析儀采集圖像。

1.2.5 明膠酶譜法檢測蛋白酶活性 利用細胞計數結果調整上樣量，利用0.1% 明膠(gelatin)－8%SDS-PAGE進行電泳。電泳結束后利用2.5%Triton X-100室溫下對膠進行洗滌兩次，每次30 min。然后在反應液中(10 mmol/L CaCl2，40 mmol/L Tris-HCl，0.01%NaN3，pH8.0)37 ℃孵育12 h。然后利用考馬斯亮藍對膠進行染色并照相，最后對結果利用Image J進行分析。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 C75對肝癌細胞增殖的影響

本研究發現C75能夠抑制肝癌細胞MHCC97H的增殖，在濃度低于10 μg/ml時，C75對MHCC97H細胞的抑制作用并不明顯。為了排除C75抑制MHCC97H細胞增殖作用對侵襲實驗結果的影響，我們選擇低于10 μg/ml的濃度進行后續實驗。從圖1可以看出在C75濃度低于10 μg/ml時，C75對MHCC97H細胞的抑制作用并不明顯;在濃度高于10 μg/ml時，能夠明顯抑制MHCC97H細胞的增殖，差異具有統計學意義。

圖1 C75對MHCC97H細胞增殖的影響Figure 1 The anti-proliferative effect of C75 on MHCC97H cells

2.2 C75對MHCC97H細胞遷徙能力的影響

C75能夠明顯抑制MHCC97H細胞的遷徙能力，從圖2中可以看出，MHCC97H細胞的遷徙能力較強，24 h后劃痕基本愈合。但2.5和5 μg/ml C75能夠明顯抑制MHCC97H細胞的遷徙能力。對結果進行統計分析后發現，C75能夠明顯抑制MHCC97H細胞的侵襲轉移，這種作用具有明顯的量效關系(圖3)。

圖2 劃痕實驗檢測不同濃度C75 作用下MHCC97H 細胞遷徙能力的變化Figure 2 The changes of MHCC97H cell after treatment with C75 for different time by wound healing assa

2.3 C75對MHCC97H細胞侵襲能力的影響

從圖4中可以看出，隨著C75濃度的增加，MHCC97H細胞的侵襲能力明顯減弱，穿過小室基底膜的細胞數目明顯減少。對結果進行統計分析后發現，C75能夠明顯抑制MHCC97H細胞的侵襲轉移，差異具有統計學意義(見圖5)。

2.4 C75 對 MHCC97H 細胞中 MMP-2，MMP-9，TIMP-1和TIMP-2表達及酶活性的影響

圖3 不同濃度C75對MHCC97H細胞遷徙能力的影響Figure 3 Effect of C75 on MHCC97H cell migration

圖4 Transwell小室法檢測不同濃度C75作用下MHCC97H細胞侵襲的能力Figure 4 Changes of the invasion of MHCC97H cells after treated by different concentrations of C75 by Transwell

本研究發現隨著 C75濃度的增加，細胞中MMP-2和MMP-9的表達水平明顯升高。同時隨著C75濃度的增加，培養基中MMP-2和MMP-9的酶活性也明顯升高，其分解明膠的能力增強。同時MHCC97H細胞中TIMP-1和TIMP-2的表達水平隨著C75濃度的增加，表達量逐漸升高(見圖 6，7)。經統計學分析發現這些作用具有明顯的量效關系(見圖6，7)。

圖5 不同濃度C75對MHCC97H細胞侵襲能力的影響Figure 5 Effect of C75 on the invasion of MHCC97H cells

圖6 不同濃度C75對MHCC97H細胞中MMPs及TIMPs蛋白表達的影響Figure 6 Effect of C75 on the expression of MMPs and TIMPs in MHCC97H cells

圖7 不同濃度C75對MHCC97H細胞中MMPs酶活性的影響Figure 7 Effect of C75 on the proteinase activities of MMPs in MHCC97H cells

3 討論

研究發現，FAS抑制劑C75對多種惡性腫瘤細胞具有明確的抑制作用，并認為FAS極有可能會成為新的抗腫瘤治療靶標［10-17］。本研究發現，在濃度大于10 μg/ml時，C75能夠抑制肝癌細胞 MHCC97H的增殖，這與先前研究結果相似［8］。由于對藥物抗侵襲能力的研究多在其無明顯抗增殖作用的劑量下進行，所以后續實驗均在低于此濃度的范圍內進行。

肝癌易發生轉移，一旦發生轉移又缺乏有效的治療手段，所以肝癌的發病率和死亡率均較高 。目前，治療肝癌細胞侵襲轉移的藥物成為研究的熱點。本實驗的目的就是探討C75對肝癌細胞的侵襲轉移的抑制作用。細胞選用了具有高侵襲轉移能力的MHCC97H細胞［7］。對腫瘤細胞侵襲轉移能力的體外檢測實驗多采取劃痕實驗和Transwell小室。本研究也采用了這兩種檢測方式，結果發現在無C75干預的情況下，MHCC97H細胞的遷徙和侵襲能力均較強。在劃痕實驗中，24 h后的劃痕基本愈合，Transwell小室中細胞穿過的數目也較多。但經C75干預后，MHCC97H細胞的遷徙能力和侵襲能力均明顯下降(圖2，3)。說明C75能夠抑制肝癌細胞的侵襲轉移。

MMP及其抑制劑TIMP在肝癌的侵襲轉移過程中發揮重要的作用。MMP能夠降解細胞外間質，以利于腫瘤細胞的遷徙和侵襲［3］。腫瘤細胞通過增加MMP的表達及其活性，并降低TIMP的活性，使得腫瘤細胞獲得較強的侵襲能力［18］。研究發現，腫瘤患者血清中MMP濃度升高，且TIMP的濃度降低，這也預示著MMP/TIMP平衡與肝癌的發生發展有著密切的關聯［19］。為了探討C75抑制肝癌細胞侵襲轉移的機制，我們檢測了C75對肝癌細胞中MMP的表達和活性，以及TIMP表達的影響。結果顯示，C75能夠抑制MHCC97H中MMP的表達和活性，同時促進TIMP的表達。

綜上，本研究發現C75能夠抑制肝癌細胞的侵襲轉移，這種作用與其對MMP/TIMP平衡的調節相關。

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