慢性丙型肝炎患者外周血中Th17細胞的變化及其意義

王 萍，胥 冰，張麗君(陜西中醫學院免疫教研室，咸陽 712046;通訊作者，E－mai:smilewangwangping@163.com)

丙型肝炎是一種由丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染機體后所引起的肝臟急慢性炎癥，目前全世界大約有2億HCV感染者，且80%為慢性丙型肝炎患者，易進展為肝硬化和肝癌，嚴重危害人民身體健康。慢性丙型肝炎的發病機制十分復雜，確切機制尚未完全清楚。Th17細胞是新近發現的具有特異細胞膜表面分子和核轉錄因子的CD4+T細胞亞群，在腫瘤、自身免疫性疾病、過敏性疾病及感染性疾病中發揮重要作用［1］。最近有研究顯示Th17細胞及效應因子IL－17可能在HCV感染過程中發揮一定的作用［2－5］。為了進一步研究Th17細胞在慢性丙型肝炎中的作用，本研究檢測慢性丙型肝炎患者外周血中Th17細胞、核轉錄因子視黃醇類孤核受體 γt(retinoid－related orphan receptor gamma－t，RORγt)mRNA 及白細胞介素 17(interleukin 17，IL－17)的水平，并初步探討其臨床意義。

1 對象和方法

1.1 研究對象

連續選擇2012－06～2013－03在陜西中醫學院附屬醫院感染科治療的慢性丙型肝炎患者60例，其中男性36例，女性24例，年齡20－63歲，平均年齡(37.19±14.07)歲。所有病例診斷符合2000年中華醫學會傳染病與寄生蟲學分會、肝病學分會聯合修訂的《病毒性肝炎防治方案》［6］，均排除其他病毒性疾病、自身免疫性、腫瘤和藥物及酒精性肝炎等，采集樣本前均未進行抗病毒治療和免疫調節治療。選擇健康體檢者40例作為對照組，其中男性22例，女性18例，年齡20－62歲，平均年齡(35.67±12.39)歲，均排除病毒性疾病、自身免疫性疾病、腫瘤和藥物及酒精性肝炎。兩組研究對象性別、年齡的比較差異均無統計學意義(性別:χ2=0.246，P=0.619;年齡:t=0.554，P=0.580)。本研究征得了陜西中醫學院倫理委員會及所有受試者的同意。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 佛波酯、離子霉素、莫能霉素、固定液、破膜液、FITC－CD4抗體及 Alexa Fluor? 647－IL－17抗體購自美國eBioscience公司，TRIzol液購自美國Invitrogen公司，cDNA 第一鏈合成劑盒購自立陶宛Fermentas公司，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ反應體系購自大連寶生物工程有限公司，ELISA試劑盒購自美國R＆D公司。

1.2.2 Th17細胞檢測 患者于清晨空腹抽取靜脈血5 ml，分離外周血單個核細胞，取3 ml單細胞懸液(1 ×106個/ml)加入佛波酯(50 ng/ml)3 μl、離子霉素(500 ng/ml)1.5 μl，混勻后 37 ℃、5%CO2孵育1 h后加入莫能霉素(蛋白轉運抑制劑)2 μl，37℃、5%CO2孵育4 h，離心洗滌細胞后加入20 μl FITC－CD4抗體，混勻后避光孵育20 min;洗滌離心后分別加入4℃ 1×固定液、37℃ 1×破膜液后洗滌重懸細胞后，加入 20 μl Alexa Fluor?647－IL－17 抗體、同型對照抗體，孵育30 min后洗滌重懸細胞。利用FACS Calibur型流式細胞儀進行檢測，通過Cellquest軟件進行收集分析數據。

1.2.3 RORγt mRNA 表達水平檢測 500 μl單細胞懸液加入500 μl TRIzol液提取細胞總RNA，利用Fermentas試劑盒進行cDNA第一鏈合成。根據Genbank RORγt、GAPDH 序列利用 Primer Premier 5.0軟件設計引物，具體序列如下:RORγt上游引物5’－GAGCCAAGGCTCAGTCATGAGAA－3’，下游引物5’－GTCCCTCTGCTTCTTGGACAT－3’，產物大小 289 bp;GAPDH 上游引物5’－GAGAAGGCTGGGGCTCATTT－3’，下游引物5’－AGTGATGGCATGGACTGTGG－3’，產物大小231 bp。利用20 μl體系進行熒光定量PCR 擴增:SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ(2×)10 μl、PCR 上下游引物(2 μmol/L)各2 μl、cDNA 6 μl。采用兩步法進行PCR擴增，95℃ 10 s預變性，然后進行如下循環:95℃ 5 s，61℃ 15 s，72℃ 30 s，共45個循環。擴增結束后采用Bio－Rad iQ520 Standard E－dition Optical System Software V2.0進行數據分析。

1.2.4 血漿中 IL－17水平檢測 利用 ELISA試劑盒檢測血漿IL－17水平，每個樣本做3個復孔，IL－17的最低檢測值小于4 pg/ml，實驗操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.3 統計學分析

采用SPSS16.0軟件進行統計分析，計數資料比較采用χ2檢驗;計量資料采用±s表示，兩組比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組研究對象外周血Th17細胞百分率的比較

流式細胞分析(以CD4+細胞為門)結果顯示，與正常對照組［(0.87±0.16)%］相比，慢性丙型肝炎患者外周血Th17細胞百分率［(1.15±0.21)%］明顯升高，差異有統計學意義(t=7.157，P=0.000，見圖1)。

圖1 兩組研究對象外周血Th17細胞百分率的比較Figure 1 Comparison of the percentage of Th17 cells in the peripheral blood between patients with chronic hepatitis C and healthy controls

2.2 兩組研究對象外周血RORγt mRNA表達水平的比較

熒光定量PCR結果顯示:慢性丙型肝炎患者外周血RORγt mRNA 表達水平(0.43 ±0.11)明顯高于正常對照組(0.32±0.09)，差異有統計學意義(t=5.257，P=0.000)。

2.3 兩組研究對象血漿中IL－17水平的比較

慢性丙型肝炎患者血漿IL－17水平明顯升高于正常對照組，差異有統計學意義［(39.43±12.61)pg/mlvs(24.07 ±8.62)pg/ml，t=6.722，P=0.000］。

3 討論

慢性丙型肝炎發病機制尚未完全清楚，有研究提示，Th細胞亞群及其相關細胞因子網絡失衡參與了慢性 HCV 感染的發生、發展［7，8］。研究表明，慢性丙型肝炎患者體內調節性T細胞增多，抑制活性增強，HCV特異性CD8+T細胞反應減低，導致HCV持續感染 。Th17細胞是新近發現的一類CD4 T細胞亞群，與調節性T細胞來源于同一前體細胞，且二者在一定條件下可以互相轉化，研究證實Th17細胞在自身免疫性疾病、腫瘤及感染性疾病中發揮重要作用［1］。近期研究發現Th17細胞在乙型肝炎感染中發揮一定作用，并與乙型肝炎慢性化及肝功能損傷有關［11－13］。

迄今為止Th17細胞在HCV發病中作用的研究甚少，且研究結果并不一致［3－5，14］，為了進一步研究Th17細胞在慢性丙型肝炎發病中的具體作用，本實驗檢測了慢性丙型肝炎外周血中Th17細胞及其主要效應分子IL－17的變化，結果發現慢性丙型肝炎患者外周血中Th17細胞百分率及血漿中IL－17水平均明顯高于正常對照組(P＜0.05)，這與國內外大多數研究結果一致［2－5］。但 Foster 等［14］研究發現慢性丙型肝炎患者肝組織內IL－17水平明顯升高，但外周血中IL－17水平與正常對照組比較差異無統計學意義，這可能與研究病例的選擇、采樣時間、Th17細胞檢測手段不同等因素有關。RORγt是視黃醇家族成員之一，研究表明RORγt是Th17細胞分化過程中關鍵的轉錄激活因子［15，16］，本實驗還發現慢性丙型肝炎患者RORγt mRNA表達水平明顯高于正常對照組(P＜0.05)，這與Th17細胞變化一致。有關HCV感染后Th17細胞增多的機制尚未清楚，國外研究發現HCV核心蛋白及NS3蛋白可以促進Th17細胞分化［17］，而轉化生長因子可以抑制HCV特異Th17細胞分化［18］。

綜上所述，慢性丙型肝炎患者體內Th17細胞百分率增加，分泌IL－17能力增強，可能參與了慢性丙型肝炎的發病過程，但本研究僅對外周Th17細胞進行了研究，如能同時對肝內Th17細胞進行研究將有助于全面了解Th17細胞在慢性丙型肝炎發病機制中的作用，可能為闡明丙型肝炎的慢性化機制及指導其治療提供理論及實驗基礎。

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