鐵線蓮“茱莉亞”的組織培養(yǎng)研究

吳榮

（西南林業(yè)大學(xué) 園林學(xué)院，云南 昆明650224）

1 引言

鐵線蓮屬（ClematisL.）植物是毛茛科（Ranunculaceae）世界著名的觀賞植物，共約300余種，廣布全球；我國有110種左右，全國各地都有分布［1］。早在1688年的《花鏡》中已有雄蕊瓣化的鐵線蓮重瓣變種的記載，但栽培育種工作卻很少有人做過。該屬植物為藤本中的佼佼者，有"攀援植物皇后"的美稱，目前國內(nèi)對鐵線蓮屬植物的研究主要集中在種質(zhì)資源調(diào)查、系統(tǒng)分類研究和栽培繁殖等方面［2］。鐵線蓮屬植物存在結(jié)實(shí)少或萌發(fā)時間長、發(fā)芽率低等問題，不宜采用有性繁殖，園林栽培應(yīng)用受到限制，組織培養(yǎng)方面的研究已逐漸展開［3～5］。“茱莉亞”是鐵線蓮屬栽培觀賞植物，使用組織培養(yǎng)技術(shù)解決鐵線蓮屬一些植物種類繁育困難的問題，不但能給城市綠地增添一道亮麗風(fēng)景，還對研究鐵線蓮屬植物種質(zhì)資源保護(hù)以及開發(fā)利用有一定的參考價值。

2 材料與方法

春季選取從歐洲引種的2年生“茱莉亞”健壯無病蟲害的當(dāng)年生嫩莖，以其莖段和莖節(jié)為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)。以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，附加不同濃度的NAA、6－BA和KT來誘導(dǎo)愈傷組織和側(cè)芽。

首先將采好的材料用抹布擦一遍，有絨毛的用膠布粘掉，然后用肥皂水浸泡20min后清水沖洗30min。將材料分成莖段和莖節(jié)分裝，莖段切成6～8cm長短，莖節(jié)以將要接種的部位為中心再加0.5cm長度剪下備用，接種時帶入接種室，用75%酒精擦拭裝材料的瓶子后放入超凈臺，再在0.1%L汞溶液中浸泡滅菌3min，無菌水清洗4次以上接種。將接種好的外植體放在溫度20～22℃、光照12h/d的環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)。

3 結(jié)果分析

3.1 外植體的選擇

外植體的選擇及接種到培養(yǎng)基中的形式是進(jìn)行組織培養(yǎng)建立無菌體系以及植株再生的關(guān)鍵。試驗(yàn)選取＇茱莉亞＇的嫩莖平躺在培養(yǎng)基中，5d后開始膨大，第11 d開始長愈傷，30d的愈傷誘導(dǎo)率為52.8%。豎插在培養(yǎng)基中的外植體有10%左右插入培養(yǎng)基部分發(fā)黃枯萎，最后死亡，40%左右沒有形成愈傷組織，大約15d左右枯死，大約30%的外植體長出黃色粒狀較堅(jiān)硬的愈傷組織，增殖緩慢。較細(xì)的外植體會在接種1d后開始發(fā)黑，7d后整個外植體死亡。所以，接種時使外植體平躺比豎插在培養(yǎng)基中的愈傷組織誘導(dǎo)率更高（表1）。

表1 嫩莖粗細(xì)程度對成活率的影響

從表1可以看出“茱莉亞”較細(xì)全部死亡，而較粗嫩莖的成活率高達(dá)96.3%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于較細(xì)嫩莖。

3.2 愈傷組織的誘導(dǎo)

將“茱莉亞”的莖節(jié)和莖段接種到 MS＋2mg/L6－BA＋0.05mg/L NAA＋1mg/LKT培養(yǎng)基中來比較不同外植體的誘導(dǎo)效果。接種第4d莖節(jié)長出側(cè)芽，第5d莖段和莖段基部開始膨大，到第10d開始形成淡黃色至綠色愈傷組織，但是都只在切口處形成少量顆粒狀質(zhì)地較硬、顏色不一的愈傷組織，不適合增殖（表2）。

表2 不同外植體愈傷組織及側(cè)芽誘導(dǎo)情況

從表2中可以看出，“茱莉亞”的莖節(jié)和莖段在形成愈傷組織和側(cè)芽上的效果相差比較大，莖段愈傷組織誘導(dǎo)率為64.4%，幾乎是莖節(jié)的2倍，但是卻無法誘導(dǎo)側(cè)芽形成。從側(cè)芽誘導(dǎo)率可以看出，雖然莖節(jié)能夠誘導(dǎo)出側(cè)芽，但是誘導(dǎo)率比較低，只有18.9%，所以在誘導(dǎo)側(cè)芽方面還有待調(diào)整。

3.3 愈傷組織增殖

將“茱莉亞”誘導(dǎo)出愈傷組織的莖段和莖節(jié)轉(zhuǎn)接到 MS＋3.0mg/L6－BA＋0.1mg/LNAA＋1.5 mg/LKT和 MS＋3.0mg/L6－BA＋0.1mg/LNAA＋2.0mg/LKT中增殖很快，3d后就能明顯觀察到愈傷組織的增大，第13d愈傷組織增大1倍，10d后＇茱莉亞＇莖節(jié)長出第一個叢生芽，形成的愈傷組織呈黃綠色光澤，質(zhì)地較軟，適合愈傷組織的增殖分化（表3）。

表3 不同KT濃度對外植體的增殖情況

由表3可以看出，不同濃度KT對愈傷增殖效果差異很大，1.5mg/LKT對莖節(jié)愈傷組織增殖率可以達(dá)到90%而2.0mg/LKT對莖節(jié)愈傷組織的增殖率僅有11.7%。由此可見，不是KT濃度越高對愈傷誘導(dǎo)率越有利。1.5mg/LKT對＇茱莉亞＇莖段和莖節(jié)的愈傷組織增殖效果相差不大，分別是98.3%和90%。莖節(jié)在1.5 mg/LKT和2.0mg/LKT中生長情況相差很大。在2.0mg/LKT中，＇茱莉亞＇繼代培養(yǎng)產(chǎn)生的側(cè)芽很少而初代培養(yǎng)出的側(cè)芽長得比較強(qiáng)壯，而且誘導(dǎo)產(chǎn)生了少量叢生芽。

4 結(jié)論與討論

4.1 結(jié)論

（1）粗嫩莖的成活率遠(yuǎn)高于細(xì)嫩莖，達(dá)到96.3%。可能較粗的嫩莖含營養(yǎng)較多，形成層薄壁細(xì)胞多，與培養(yǎng)基接觸面大，易于吸收營養(yǎng)，消毒過程中不容易被殺死，存活力強(qiáng)。外植體平放在培養(yǎng)基中愈傷組織誘導(dǎo)率高于豎插。

（2）MS＋2.0mg/L6－BA＋0.05mg/LNAA＋1.0 mg/LKT對“茱莉亞”莖段愈傷組織的誘導(dǎo)優(yōu)于莖節(jié)，達(dá)到64.4%，但無法誘導(dǎo)形成側(cè)芽。

（3）MS＋3.0mg/L6－BA＋0.1mg/LNAA＋1.5 mg/LKT適合“茱莉亞”愈傷組織的增殖，不管是莖段還是莖節(jié)，增殖率都在90%以上，莖段的增殖率甚至高達(dá)98.3%。

4.2 討論

（1）外植體平躺在培養(yǎng)基中愈傷組織誘導(dǎo)率高于豎插，可能是“茱莉亞”對激素濃度比較敏感，豎插在培養(yǎng)基中部分因切口吸收激素快且濃度過高而抑制生長，最后枯萎死亡；而平躺的外植體與培養(yǎng)基接觸面積較大，吸收激素速度及濃度合適，因而促進(jìn)了生長。

（2）新萌蘗莖段和幼嫩新梢本身含病毒少或無毒，處于植物生理上線、營養(yǎng)生長中心和頂端分生組織，幼年的組織都比老年的組織有較高的形態(tài)發(fā)生能力［6］，但是幼嫩外植體易損傷，消毒時間不宜過長也不能太短。

（3）在增值過程中KT濃度不是越高越好。1.5 mg/LKT對＇茱莉亞＇的愈傷組織增殖效果很好，對側(cè)芽誘導(dǎo)效果很不明顯；2.0mg/LKT對愈傷組織增殖和側(cè)芽誘導(dǎo)效果都不明顯，這可能是因?yàn)镹AA和6－BA協(xié)同作用的結(jié)果。在植物組織培養(yǎng)中，植物生長調(diào)節(jié)劑是培養(yǎng)基中必不可少的成分，它能以極微小的量影響植物細(xì)胞分化、分裂和發(fā)育，影響植物的形態(tài)建成、開化、結(jié)實(shí)、成熟、脫落、衰老和休眠、萌發(fā)等許多的生理生化活動。

［1］中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會.中國植物志［M］.北京：科學(xué)出版社，1980.

［2］蔡艷飛，李世峰，李 涵，等.中國鐵線蓮屬植物研究進(jìn)展［J］.中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2009，25（4）：195～198.

［3］倪 新，馬 毓.紅花鐵線蓮的組織培養(yǎng)［J］.植物學(xué)通報(bào)，1984，2（2/3）：71～73.

［4］澤仁旺姆，尼 珍，潘 多.西藏甘青鐵線蓮的再生植株［J］.西藏科技，2002，113（9）：61.

［5］張啟香，方炎明，呂 梅，等.鐵線蓮＇Multi－Blue＇不定芽及體細(xì)胞胚發(fā)生的初步研究［J］.園藝學(xué)報(bào)，2007，34（2）：365～368.

［6］李淑瑜.大葉女貞快繁體系研究［D］.河南：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.