外周血腫瘤壞死因子－α信使核糖核酸表達(dá)及與核因子－κB活化與慢性心力衰竭嚴(yán)重程度的臨床研究

楊麗霞，呂晉琳，齊峰，葉金善，郭瑞威，石燕昆

慢性心力衰竭（CHF）時(shí)細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)失衡既是其結(jié)果，又成為維持與加重心衰和心肌重塑的原因。其中，腫瘤壞死因子-α（TNF-α）是參與心肌重塑、心衰進(jìn)展最為密切的細(xì)胞因子之一，可作為判斷心衰程度和預(yù)后的指標(biāo)[1]。核因子-κ B（NF-κ B）為調(diào)節(jié)細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵因子，近年研究表明除了心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞外，外周血單個(gè)核細(xì)胞中也存在NF-κ B激活通路[2]。本研究通過探討CHF患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中NF-κ B的活化程度及其與TNF-α基因表達(dá)的關(guān)系，旨在闡明NF-κ B活化、TNF-α表達(dá)在心肌重塑和CHF中的病理意義。

1 資料與方法

研究對(duì)象： 我院心內(nèi)科2006-10至2007-08住我院的CHF患者76例為CHF組，其中男40例，女36例，平均年齡（56.8±8.7） 歲，心功能NYHA分級(jí)Ⅱ～ Ⅳ級(jí)，病因?yàn)閿U(kuò)張型心肌病和缺血性心肌病，左心射血分?jǐn)?shù)＜50 %。對(duì)照組為我院同期門診健康體檢者，共30例，男13 例，女17例，平均年齡（51.2±10.6） 歲， 所有受試者均除外感染、哮喘、風(fēng)濕活動(dòng)、腎衰竭和腫瘤等疾病。

超聲心動(dòng)圖（UCG）檢查，使用惠普5500型彩色多普勒超聲心動(dòng)圖儀，探頭頻率2～4 MHz ，分別測(cè)定左心房?jī)?nèi)徑（LAD），左心室舒張末內(nèi)徑（LVDd），左心室后壁厚度（LVPW）。采用Simpson法，描記舒張期和收縮期心內(nèi)膜邊緣，計(jì)算機(jī)自動(dòng)描記室壁運(yùn)動(dòng)曲線，根據(jù)左心室舒張末容積（LVEDV）和左心室收縮末期容積（LVESV） ，計(jì)算左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左心室短軸縮短率（LVFS） 、心輸出量（CO）和心指數(shù)（CI），并按Devereux公式計(jì)算左心室重量（LVMW）及左心室重量指數(shù)（LVMI），LVMW = 1.04[ （ IVST + LVDD +LVPW）3- LVDD3] -13.6 （g）；LVMI = LVMW/體表面積 （g/m2）。

外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離： 用滅菌的肝素抗凝管抽取外周血5 ml，采用密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）。用含10%新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞數(shù)為2×106/ ml的細(xì)胞懸液[2]。

細(xì)胞核蛋白的提?。簠⒄誃iosource公司提供的細(xì)胞裂解液及核蛋白抽提液配方，離心收集外周血單個(gè)核細(xì)胞，將細(xì)胞懸浮于500μl細(xì)胞裂解液冰浴15 分鐘，加入 25μl 10%NP-40 溶液，混勻后 3000 g 4℃離心10分鐘，沉淀重懸于50μl核蛋白抽提液，冰浴30分鐘，4℃高速離心30分鐘，取上清分裝并立即保存于-80℃冰箱待用。

NF-κB濃度檢測(cè)： NF-κB試劑盒（cat KHO0371）購(gòu)于Biosource公司（美國(guó)），按試劑盒說明書操作。用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)核蛋白提取物NF-κ B在波長(zhǎng)450 nm處的吸光度值（OD值）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)OD值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出NF-κB濃度。

逆轉(zhuǎn)錄－多聚酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）：用滅菌的肝素抗凝管抽取外周血5 ml，采用密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞。 用Trizol 法提取細(xì)胞總RNA。TNF-α 引物序列 ：上游 5-CTT CTC CTT CCT GAT CGT GG-3 ，下游 5-GCT GGT TAT CTC TCA GCT CCA-3。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內(nèi)對(duì)照，產(chǎn)物長(zhǎng)度分別為226 bp和266 bp。TNF-α反應(yīng)條件為 94℃ 變性 1 min ，60℃ 退火 2 min ，72 ℃延伸1 min ，循環(huán)35次。GAPDH退火溫度為64℃，循環(huán)30 次，其余條件相同。PCR 產(chǎn)物于2 %瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，紫外燈下觀察拍照，應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)對(duì)電泳帶進(jìn)行光密度值測(cè)定，以光密度比值作為TNF-αmRNA 相對(duì)定量表達(dá)水平。

2 結(jié)果

CHF組NF-κ B水平和TNF-αmRNA表達(dá)較對(duì)照組明顯增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。CHF組隨著心功能惡化，NF-κB水平、TNF-αmRNA表達(dá)逐漸升高，CHF組與對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。（表 1、圖 1）

表1 兩組外周血單個(gè)核細(xì)胞腫瘤壞死因子-α信使核糖核酸表達(dá)與核因子-κ B水平（±s）

表1 兩組外周血單個(gè)核細(xì)胞腫瘤壞死因子-α信使核糖核酸表達(dá)與核因子-κ B水平（±s）

注：與對(duì)照組相比 * P＜0.01 。TNF-α mRNA：腫瘤壞死因子 -α 信使核糖核酸 NF-κ B：核因子 -κB

組 別 例 數(shù) TNF-αmRNA NF-κ B（pg/ml）對(duì)照組 30 0.08±0.04 23.86±7.08慢性心力衰竭組 76 0.30±0.11* 46.89±17.36*心功能II級(jí) 27 0.18±0.07* 38.54±5.23*心功能III級(jí) 34 0.34±0.06* 39.28±12.87*心功能IV級(jí) 15 0.42±0.06* 62.01±10.83*

圖1 逆轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈反應(yīng) 分析電泳后外周血單個(gè)核細(xì)胞的腫瘤壞死因子-α和甘油醛-3-磷酸脫氫酶的信使核糖核酸表達(dá) 1：對(duì)照組 2：心功能Ⅱ級(jí) 3：心功能Ⅲ級(jí) 4：心功能Ⅳ級(jí)。TNF-α：腫瘤壞死因子 -α GAPDH：甘油醛 -3- 磷酸脫氫酶

CHF組 NF-κB水平與 TNF-α mRNA 表 達(dá) 呈正相關(guān)（r=0.658，P＜0.01），建立回歸方程為 y＝0.139+0.004X。

CHF患者兩指標(biāo)與心功能的相關(guān)性分析： NF-κ B水平及TNF-α mRNA表達(dá)均與左心室射血分?jǐn)?shù)、心輸出量、心指數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與左心室短軸縮短率負(fù)相關(guān)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（表2）

CHF患者兩指標(biāo)與心臟結(jié)構(gòu)的相關(guān)性分析：NF-κ B水平與左心室舒張末期內(nèi)徑、左心室收縮末容積、左心室舒張末期容積、左心室重量指數(shù)呈顯著正相關(guān)，P均 ＜0.05。差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。TNF-α mRNA與左心室舒張末期內(nèi)徑、左心室重量指數(shù)呈顯著正相關(guān)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05～0.01）。（表 3）

表2 慢性心力衰竭患者外周血單個(gè)核細(xì)胞核因子-κ B水平和腫瘤壞死因子-α信使核糖核酸表達(dá)與心功能的相關(guān)性分析

表3 慢性心力衰竭患者外周血單個(gè)核細(xì)胞核因子-κ B和腫瘤壞死因子-α信使核糖核酸與心臟結(jié)構(gòu)的相關(guān)性

3 討論

20世紀(jì)后期，人們認(rèn)識(shí)到CHF預(yù)后差，主要是由于神經(jīng)體液因素和心肌重構(gòu)造成的惡性循環(huán)不斷進(jìn)展的結(jié)果[3，4]。近年來在CHF的病理生理機(jī)制中引入了細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)失衡學(xué)說[5,6]，認(rèn)為細(xì)胞因子與神經(jīng)內(nèi)分泌激活使CHF惡化?；A(chǔ)研究已證實(shí)活化的NF-κ B核定位序列暴露并發(fā)生核移位，能與DNA上特異性κ B序列結(jié)合并啟動(dòng)靶基因的轉(zhuǎn)錄，其中包括對(duì)細(xì)胞的活化、增殖、分化和分泌起直接調(diào)控的細(xì)胞因子，例如TNF-α的轉(zhuǎn)錄[7]。除了心肌細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞外，外周血單個(gè)核細(xì)胞中也存在著TNF-α的轉(zhuǎn)錄翻譯以及NF-κ B的激活通路[8]。

本研究結(jié)果顯示，CHF患者外周血單個(gè)核細(xì)胞NF-κ B水平和TNF-αmRNA表達(dá)顯著高于對(duì)照組，且TNF-αmRNA表達(dá)與NF-κ B的水平呈顯著正相關(guān)。TNF-αmRNA表達(dá)和NF-κ B濃度均與心功能指標(biāo)及心肌重塑超聲心動(dòng)圖指標(biāo)相關(guān)。說明TNF-αmRNA表達(dá)的增加可能與NF-κ B活化有關(guān)，兩者相互作用共同促進(jìn)心肌重塑和心肌收縮力減弱，從而導(dǎo)致心功能惡化。其可能機(jī)制為CHF時(shí)機(jī)體處于高炎癥反應(yīng)狀態(tài)，脂多糖（LPS） 與LPS結(jié)合蛋白（LBP） 結(jié)合，再與脂多糖在巨噬細(xì)胞表面的特異性結(jié)合受體CD14 相互作用，激活蛋白酪氨酸激酶（PTK） 通路：Ras →Raf →MEK→MAPK→NF-κ B，被活化的NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，激活TNF-α啟動(dòng)子使之轉(zhuǎn)錄[9]。CHF 時(shí)的血流動(dòng)力學(xué)因素如心率、左房壓、平均動(dòng)脈壓、肺動(dòng)脈楔壓、左室射血分?jǐn)?shù)和生化因素如腎上腺素、NE、ET、AngⅡ 及心肌缺血、缺氧、室壁應(yīng)力增大等都可刺激單核－巨噬細(xì)胞等合成和分泌TNF-α，在TNF-α表達(dá)增加的同時(shí)TNF-α受體結(jié)合NF－κB誘導(dǎo)激酶（NIK）途徑進(jìn)一步激活NF-κ B，如此循環(huán)作用導(dǎo)致TNF -α不斷增加，抑制心肌收縮、誘發(fā)心肌細(xì)胞凋亡和基質(zhì)纖維增生，加重心力衰竭[10,11]。

綜上所述，NF-κ B細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及TNF-α參與了慢性心力衰竭的發(fā)生、發(fā)展，并與心功能惡化及心肌重塑同步。如何阻斷這一通路的激活將給CHF的治療帶來新的希望?；趯?duì)慢性心力衰竭發(fā)生機(jī)制的研究，除了臨床上較常使用的增強(qiáng)心肌細(xì)胞收縮能力、減輕前后負(fù)荷等藥物外[12]，一些拮抗細(xì)胞因子作用的藥物如p38 MAPK抑制劑以及針對(duì)NF-κ B信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的特異性阻斷劑如吡咯烷二硫氨基甲酸酯（pyrrolidine dithiocar-bamates，PDTC）等的應(yīng)用仍有待進(jìn)一步研究[13]。

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