水紅花子總黃酮的超聲波提取及抗氧化性研究

張雁南，劉 剛，宋文爽

（吉林工程技術師范學院食品工程學院，吉林長春 130052）

黃酮類化合物(Falconoid)，又稱生物類黃酮(Bioflavoniod)，早期是指具有乙-苯基吡喃酮結構的一類黃色素，現指具有色酮環與苯環為基本結構的一類化合物的總稱[1]。黃酮類化合物廣泛存在于植物中，是植物長期自然選擇過程中產生的次級代謝產物[2]。黃酮類化合物具有抗氧化[2]、抗腫瘤[2]、抗糖尿病及其并發癥[2]、抗病毒[1]等多種生物活性。黃酮類化合物廣泛應用于醫藥、食品等領域，在食品中的可用作抗氧化劑、甜昧劑等[2]，醫藥方面用于開發抗心血管病藥物、抗肝臟毒素藥、止咳平喘藥等[1]。

水紅花子為蓼科(Polygonaceae)蓼屬(Polygonum)桃葉蓼組植物紅蓼Polygounum orientale L.的干燥成熟果實[3]。藥理研究報道水紅花子具有抗腫瘤、抑菌、利尿作用，現代臨床新用治療肝硬化、乙型肝炎、抗凝血[3]。水紅花子主要含有槲皮素、花旗松素等數種黃酮類成分[4]。

黃酮類化合物傳統提取方法有有機溶劑提取、熱水提取、堿性水或堿性稀醇提取、系統溶劑提取法等[5]，新型提取技術有超聲波提取法、微波提取法、酶解法、超臨界流體萃取法、半仿生提取法等[5]。目前，關于水紅花子總黃酮提取工藝研究的報道較少，本文進行了水紅花子總黃酮的超聲波提取及抗氧化性研究，旨在為水紅花子功能成分的應用和生產提供數據依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

水紅花子，采自長春市郊，除雜，于40℃干燥箱中干燥至恒重，粉碎后過40目篩。

95%(v/v)乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、硫酸亞鐵、水楊酸、雙氧水（均為分析純，北京化工廠）；蘆丁標準品(純度≥98%，中國藥品生物制品檢定所)。

1.2 儀器與設備

LK-400A型粉碎機（上海超億制藥機械設備有限公司）；SHZ-DⅢ循環水真空泵（北京市永光明醫療儀器廠）；FA2204B電子天平（上海精密科學儀器有限公司）；UV2000紫外可見分光光度計（尤尼柯(上海)儀器有限公司）；KQ-100DB型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DHG-06-100B型電熱恒溫箱（武漢海聲達儀器設備有限公司）；DZKW-S-4電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫療儀器廠）。

1.3 方法

1.3.1 樣品總黃酮提取液的制備和總黃酮含量的測定

以蘆丁為標準樣品，參照文獻[6]進行標準曲線的繪制和樣品提取液中總黃酮含量測定，得標準曲線方程y=0.0111x+0.0567，R2=0.9998。

精密稱取水紅花子粉末5.00g，加入乙醇溶液室溫下浸泡一定時間后，在一定條件下超生波輔助提取一定時間，過濾，定容至250mL，精密吸取0.5mL樣品提取液，測定吸光度，計算樣品提取液中總黃酮的含量。

1.3.2 羥自由基(·OH)清除率測定[7-9]

向150mL的錐形瓶中依次加入濃度為6mmol·L-1的FeSO4溶液和H2O2溶液各30mL，混勻，加入6mmol·L-1水楊酸溶液45mL，37℃水浴下反應15min，然后在波長510nm處測定其吸光度A0；取5支比色管，依次向其中加入以上的測定體系7mL，之后分別向5支比色管中加入水紅花子總黃酮提取液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，加蒸餾水定容到10mL，搖勻，在37℃水浴中反應15min，再于波長510nm處分別測定其吸光度Ax，以下式計算羥自由基清除率。

1.3.3 試驗設計

1.3.3.1 單因素試驗

基礎條件：5.00g水紅花子粉末、乙醇濃度55%(v/v)、料液比1:12(g·mL-1)、提取溫度40℃、功率100W、提取時間30min、提取次數1次、浸泡2h。

各因素水平：乙醇濃度35、45、55、65、75、85、95%(v/v)；提取溫度20、30、40、50、60、70、80℃；超生波功率40、50、60、70、80、90、100W；提取時間5、10、20、30、40、50、60min；料液比1:6、1:9、1:12、1:15、1:18、1:21、1:24、1:27(g·mL-1)；提取次數1次、2次、3次、4次；浸泡時間0、2、4、6、8、12、16、20、24h。

1.3.3.2 正交試驗設計

根據單因素試驗結果，選擇對水紅花子總黃酮提取效果影響較大的4個因素，進行L9(34)正交試驗優化水紅花子總黃酮的提取工藝。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 乙醇濃度對水紅花子總黃酮提取量的影響

圖1 乙醇濃度對總黃酮提取量的影響

由圖1可知，水紅花子總黃酮提取量隨著乙醇濃度的增加呈現先上升后下降的趨勢，在乙醇體積分數55%時提取量最大。因此選擇乙醇濃度45%～65%(v/v)作為優化范圍。

2.1.2 提取溫度對水紅花子總黃酮提取量的影響

圖2 提取溫度對總黃酮提取量的影響

由圖2可知，水紅花子總黃酮的提取量隨著溫度的提高而增加，因此提高溫度有利于總黃酮的提取。但是溫度過高，一方面使其中的活性成分易受到破壞，雜質的溶出量增加，給后續操作帶來不便，成本費用增大；另一方面造成溶劑損失[10]。本文使用的超聲波清洗器最大操作溫度為80℃，綜合考慮，選擇60～80℃作為提取溫度的優化范圍。

2.1.3 超聲波功率對水紅花子總黃酮提取量的影響

圖3 超聲波功率對總黃酮提取量的影響

圖4 提取時間對總黃酮提取量的影響

由圖3可知，總黃酮的提取量隨超聲波功率的增加而增加，因此超生波清洗器功率調整到最大功率100W為宜。

2.1.4 提取時間對水紅花子總黃酮提取量的影響

從圖4可知，提取時間30min之后水紅花子總黃酮提取量增加緩慢，選擇30～50min為提取時間的優化范圍。

2.1.5 料液比對水紅花子總黃酮提取量的影響

由圖5可知，水紅花子總黃酮提取量隨著料液比的減小而增大，料液比降到1:18(g·mL-1)以下后，隨提取劑用量的增加總黃酮提取量增加不大，因此選擇1:15～1:21(g·mL-1)為料液比優化范圍。

2.1.6 提取次數對水紅花子總黃酮提取量的影響

圖5 料液比對總黃酮提取量的影響

圖6 提取次數對總黃酮提取量的影響

由圖6可知，提取4次的提取量為2.01%，認為提取4次總黃酮提取完全。提取2次后，總黃酮提取量增加不大，提取2次的提取量為1.87%，占提取4次的總提取量的93%，再增加提取次數會浪費溶劑、浪費時間，因此確定提取次數為2次較為適宜。

2.1.7 浸泡時間對水紅花子總黃酮提取量的影響

圖7 浸泡時間對總黃酮提取量的影響

由圖7可知，對原料先浸泡一定時間再超聲波輔助提取，有利于黃酮類化合物的溶出，水紅花子粉末浸泡16h時總黃酮提取量最大，繼續延長浸泡時間雜質溶出量增加，干擾測定，曲線呈現下降趨勢，因此浸泡時間選擇在16h較適宜。

2.2 水紅花子總黃酮提取工藝條件的優化

在超生波功率100W、浸泡2h、提取1次的條件下，進行L9(34)正交試驗，正交試驗因素水平見表1，正交試驗結果見表2。

表1 正交試驗因素水平表

表2 L9(34)正交試驗結果

由R可知，4因素對水紅花子總黃酮提取效果的影響程度是A＞D＞C＞B。比較k值大小得出最佳提取工藝條件為A3B2C3D2，此條件下提取1次的提取量為2.89%，大于表2中A3B1C3D2條件下的2.68%，因此確定水紅花子總黃酮的最佳提取工藝條件為浸泡16h、超聲功率100W、乙醇濃度55%(v/v)、提取溫度70℃、料液比1:18(g·mL-1)、超聲波輔助提取時間40min、提取2次，最佳條件下總黃酮的提取量為6.14g/100g。

2.3 羥自由基(·OH)清除率的測定

取5g水紅花子粉末，在最佳提取工藝條件下提取總黃酮，提取液定容至250mL，稀釋2倍，按照1.3.2節方法測定水紅花子總黃酮對羥自由基(·OH)的清除率。由圖8可知，水紅花子總黃酮具有清除羥自由基(·OH)的能力。

圖8 總黃酮對·OH的清除作用

3 結論

超聲輔助提取技術(UAE)是利用超聲波的強振動、高加速度、強空化效應、強攪拌作用來縮短天然產物有效成分進入溶劑的時間，加快提取過程，提高提出率，并有效避免高溫對有效成分的破壞[11]。本文采用超生波輔助法提取水紅花子總黃酮，利用正交試驗確定最佳工藝條件為浸泡16h、超聲波功率100W、乙醇體積分數55%、提取溫度70℃、料液比1:18(g·mL-1)、超聲波輔助提取時間40min、提取2次。羥自由基是已知最強的氧化劑，對細胞和組織的破壞作用最大[7]，本文的抗氧化實驗表明，水紅花子總黃酮提取物對羥自由基(·OH)具有清除作用。

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