流式細胞儀及其臨床應用

劉波

宜昌市第二人民醫院，設備科湖北 宜昌 443000

LIU Bo

Department of Equipment, The Second Hospital of Yichang, Yichang Hubei 443000, China

作為應用流式細胞術（Flow Cytometry，FCM）進行檢測的技術平臺，現代流式細胞儀產生于20世紀60～70年代。經過近40年的發展和完善，今天的流式細胞儀已經十分成熟，并被廣泛的運用于從基礎研究到臨床實踐的各個方面，涵蓋了細胞生物學、免疫學、血液學、腫瘤學、藥理學、遺傳學及臨床檢驗等領域，在各學科中發揮著重要的作用。隨著現代科技的高速發展，為了滿足生命科學對細胞分析更高層次的要求，流式細胞技術已經在檢測技術、分選技術及高通量分析等方面取得了許多突破。流式細胞儀是以激光為光源，集流體力學技術、電子物理技術、光電測量技術、計算機技術以及細胞熒光化學技術、單克隆抗體技術為一體的新型高科技儀器。

1 流式細胞儀的工作原理[1-4]和基本結構

1.1 流式細胞儀的工作原理

流式細胞儀用于檢測單細胞或微粒的信號，一般是將待測細胞或微粒進行熒光染色后制成懸液標本，在一定氣體壓力下將待測樣品壓入流動室，不含細胞或微粒的緩沖液（又稱鞘液）在高壓下從鞘液管噴出，鞘液管入口方向與待測細胞或微粒流成一定角度，使鞘液包繞著細胞或微粒高速流動，形成一個圓形的流束（即鞘流），待測細胞在鞘液的包裹下單行排列，依次通過流式細胞儀的檢測區域。激發光源經過聚焦整形后的光束垂直照射在樣品流上，被熒光染色的細胞在激光束的照射下產生激發熒光，同時產生散射光。這兩種光信號被在90°方向的光電倍增管熒光檢測器和前向角光電二極管散射光檢測器接收，經光電倍增管接收后可轉換為電信號，再通過A/D轉換器，將轉換來的電信號轉換為數字信號輸送給計算機。計算機將各種數字信號進行計算處理后，得到相應的細胞大小、活性、細胞內細胞因子、DNA含量和細胞周期、核糖核酸（Ribonucleic Acid，RNA）含量、酶和抗原的性質等參數。

細胞的分選是通過分離含有單細胞的液滴而實現的。在流動室的噴口上配有一個頻率為30 kHz的壓電晶體，充電后振動，使嘖出的液流斷裂為一連串均勻的液滴，待測細胞就分散在這些液滴之中。將這些液滴充以正、負不同的電荷，當液滴流經帶有幾千伏的偏轉板時，在高壓電場的作用下偏轉，落入各自的收集容器中，不予充電的液滴落入中間的廢液容器，從而實現細胞的分離。

1.2 流式細胞儀的基本結構[5-11]

以庫爾特FC50和BD公司的LDR流式細胞儀為例，流式細胞儀的基本結構可以分為液流系統、光學檢測系統以及數據轉換處理系統三部分。

1.2.1 液流系統

液流系統是流式細胞儀的核心部件。流動室由石英玻璃制成，并在石英玻璃中央開一個微孔，供細胞單個流過，檢測區在該孔的中心，流動室內充滿了鞘液,鞘液的作用是將樣品流環包。樣品流在鞘流的環包下聚焦，保證每個細胞通過激光照射區的時間相等，從而得到準確的細胞熒光信息。液流驅動系統由空氣泵、壓力調節、壓力傳感器等組成。空氣泵產生壓縮空氣，通過鞘流壓力調節器加在鞘液上一恒定的壓力，這樣鞘液可勻速流過流動室。

鞘流原理：根據流體力學理論，流動的液體分為穩流和湍流兩種狀態。1883年雷諾發現了液體流動狀態的分界點，即雷諾系數，其定義為：在一個直徑為d的管子內，液體的流速為v，密度為ρ，黏滯系數為n，Re = dρv/n。當Re＞2300 時，液流處于穩流狀態；當Re＜2300時，液流處于湍流狀態。

在流式細胞儀中，希望標本處于穩流狀態。如果標本流的直徑固定為100μm，根據水密度和黏粘滯系數帶入公式可計算出v=23 m/s，這就是保持標本流穩定的最高速度，考慮到標本流和管壁之間的浸潤情況，常把流速限制在10 m/s以下。

為了穩定標本流的直徑，流動室在設計時還利用了液流的聚焦作用。根據流體力學的伯努利定律， S1V1=S2V2，S和V分別為兩個管道的截面積和液體流速。在流動室中，S1>S2，則V2>V1。當兩個截面積突然發生變化時，液流從截面積大的部分流入截面積小的部分后，并非全部形成于管壁的穩流，而是在入口處有一段收縮的區域，這種現象稱為液流聚焦，見圖1。在細胞儀中常把激光激發點設在此處。由于標本流變小，通常為10～20μm，可避免多個細胞重疊進入檢測區，只需要簡單的改變標本的濃度，就可以設置細胞流經激發點的平均距離，使其間隔達數百μm，從而實現對單個細胞的測量。

圖1 液流聚焦示意圖

1.2.2 光學檢測系統

現代流式細胞儀的激發光源通常采用激光，由于激光焦點處能量分布為正態分布，中心處能量最高。因此，當樣本速率選擇高速時，處在樣本流不同位置的細胞或顆粒，受激光照射的能量不一樣，從而被激發出的熒光強度也不相同。流式細胞儀光路布局為多個波長的激光器通過棱鏡組聚集成一束光束，在通過消色差透鏡聚焦到流動室上，對標本液流進行照射。標本被激光照射后產生前向散射光（FSC）和側向散射光（SSC）及側向熒光（SFL）。在流式細胞分析中，需要針對細胞的熒光特性進行分析，所以采用前向散射光和側向熒光對細胞進行分析。

前向散射光（FSC）主要為了獲取細胞體積大小的數據，散射光經過透鏡、狹縫、濾光片后被光電接收二極管采集，送往后續電路處理分析。側向熒光（SFL）主要是分析細胞的熒光特性，根據熒光探針的機理，細胞被熒光染料著色后，在相應波長的激光照射下，激發熒光，在該波長下顯現出該細胞特有的熒光特性，從而進行準確計數和分析。側向散射光（SSC）則對細胞的內容物核質比等信息進行分析，作為流式細胞分析的輔助手段，該項技術在血細胞分析儀中成為篩選分析細胞類型的手段。側向熒光（SFL）經過透鏡和不同波長的分光器，分送到各個光電倍增管（PMT）中進行信號接收，并送往后續電路進行分析。側向散射光（SSC）一般經過分光后直接交給光電二極管進行接收分析。

1.2.3 數據轉換處理系統

（1）電子系統。流式細胞儀的電子系統主要由光電轉換器件光電二極管、PMT和信號處理電路組成。PMT可將光子轉換為電子，當一個光子到達PMT的光電陰極時，可產生數十萬的電子。流式細胞儀中所用PMT的電流放大倍數可達106，但是從統計學角度來說，為了保證檢測的靈敏度和精密度，最好能從整體中抽取更多的樣本進行分析，測定結果才會更準確地反映整體的真實情況，精密度會更好。光電轉換器件可將光信號轉換為電流信號，但傳統的模擬電路更適合處理電壓信號而不是電流信號，需要由前置放大電路進行處理。前置放大電路是流式細胞儀信號處理電路中的第一個環節，它將電流信號轉換為電壓信號，同時可調整直流背景噪音為零，也就是說，在沒有光信號進入時所輸出的電壓值為零。前置放大器的性能(增益、信噪比)是決定整個流式細胞儀電子系統輸出信號質量的關鍵部分。前置放大電路所輸出的電壓信號為脈沖信號，脈沖高度與入射光信號的強度成正比，其峰值為被測細胞通過光束中心位置時所產生的最強信號。為了記錄這一峰值信號，在前置放大電路之后使用了峰值檢測器，峰值檢測器可在信號脈沖消失之后保持峰值信號，直到模/數轉換電路將模擬的峰值信號轉換為數字信號之后才重新復位，記錄下一個信號。

（2）計算機系統。計算機系統用于控制整個儀器的運行和數據采集、數據分析。操作平臺上BD流式細胞儀應用了蘋果系統而貝克曼庫爾特流式細胞儀大多為WINDOWS界面,方便用戶對數據和圖片的處理、打印報告單及論文資料的整理發表、硬件升級以及網絡化管理等，同時它用于對儀器的硬件部分進行控制，實現數據的采集和對數據的分析。

流式細胞儀的數據格式為FCS2.0，是國際分析細胞學學會ISAC修改確定的。

數據分析模式為列表模式（List Mode）和直方圖模式（Histogram Mode），前者將每個細胞各個檢測參量一次排列存儲。如1個細胞被激光照射后，會產生多個數據：前向散射光、側向散射光、數個熒光信號，這些數據被列表保存。優點是可對原數據進行再處理和分析，缺點是文件體積較大，不夠直觀。后者只能記錄每個樣本檢測結果的圖形數據，可以顯示和打印文件，文件體積小，但不能對原始數據進行再次分析。

流式細胞分析的設門，是伴隨數據的圖形化分析而產生的，指在細胞分布圖中指定一個范圍或一片區域，對其中的細胞進行單參數或多參數分析。門的形狀包括線性門、矩形門、圓形門、多邊形門、任意形狀門、四象限門。反向設門用于FSC/SCC散點圖中細胞群間相互重疊的情況。

2 流式細胞儀的臨床應用

流式細胞儀目前被廣泛應用于細胞生物學、植物學、分子生物學、生物化學、微生物學等理論科學的研究和臨床醫學的疾病診斷、治療和監測等醫療實踐中[12-14]。

2.1 流式細胞儀在免疫學中的應用

利用多參數FCM，對淋巴細胞比例、淋巴細胞中T、B、NK細胞的比例及T細胞亞群及細胞表型進行分析[15]。

2.2 細胞周期測定和DNA倍體分析[16-17]

細胞增殖周期分為G0、G1、S、G2、M期。S期是DNA合成期，在S期內，DNA進行復制，使細胞的DNA含量由2倍體(46條染色體)變為4倍體。G1和G2期為DNA合成前、后期，這兩個時期無DNA的合成，但RNA和蛋白質進行合成。M期為有絲分裂期，在此期一個細胞分裂為2個細胞。細胞內的92條染色體分裂成2組46條染色體，使每個細胞內具有46條染色體。在M期分裂成2個子細胞之前，G2和M期細胞的DNA含量均為恒定的4C。M期以后部分細胞進入G1期，繼續進行增殖，部分細胞進入G0期，即靜止期，不再繼續增殖。

利用DNA的熒光染料碘化丙啶（Propidium Iodide，PI），與細胞內的DNA結合，可反映細胞內DNA含量，用DNA直方圖顯示。FCM分析一個群體細胞峰DNA倍體與細胞周期，將DNA含量直方圖分為3部分，即G0/G1,S,G2/M期3個細胞峰。G0/G1和G2/M細胞峰DNA的含量成正態分布，S期細胞峰則是一個加寬的正態分布，具有2倍體DNA含量細胞為G0/G1期細胞，4倍體DNA含量細胞為G2/M期細胞，DNA含量介于兩者之間的細胞為S期細胞。

DNA倍體用DNA指數（DIVA Index, DI）表示，DNA指數是指測量樣本G0/G1期DNA含量與正常人淋巴細胞G0/G1期DNA含量的比值。正常細胞DNA指數為1.00，DNA指數> 1，為超2倍體，< 1為亞2倍體，兩者可統稱為非整倍體。非整倍體細胞中腫瘤的特異性標志，是癌前病變發生癌變的一個重要指標。

2.3 流式細胞儀在血液系統疾病檢測中的應用

FCM通過對外周血細胞或骨髓細胞表面抗原和DNA的檢測分析，對各種血液病的診斷、預后判斷和治療起著舉足輕重的作用[18-20]。

（1）白血病的診斷和治療。FCM采用各種抗血細胞表面分化抗原(cD)的單克隆抗體，借助于各種熒光染料測定一個細胞的多種參數，以正確地判斷出該細胞的屬性。各種血細胞系統都具有其獨特的抗原，當形態學檢查難以區別時，免疫表型參數對各種急性白血病的分型診斷和鑒別診斷有決定性作用。同其他腫瘤的治療一樣，測定DNA倍體和進行細胞周期分析對指導白血病化療有一定作用，不同的白血病患者或同一患者在不同病期白血病細胞增殖狀況不同，定期了解細胞增殖情況采取相應藥物可以提高療效。FCM通過對人白細胞抗原(HIA)配型的測定可以為異體干細胞移植病人選擇出最合適的供體。FCM測定CD34HLA—DR、CD33等細胞表面標記物，是干細胞移植術重要的監測手段。用FCM檢測一系列指標觀察病人的恢復狀態，可以對預后做出早期的判斷。

（2）其他種類血液病的診斷和治療監測。陣發性睡眠性血紅蛋白尿癥是一種造血干細胞克隆病，細胞CD44、CD59抗原表達減低是該病的一個特點。該抗原屬于血細胞表面磷脂酰肌醇錨連蛋白家族，是重要的補體調節蛋白，它通過與補體C8、C9的結合以阻止補體膜攻擊復合物的形成，從而抑制細胞被補體系統溶解。FCM采用熒光標記的單克隆抗體對血細胞CD59的表達做定量分析，可以協助臨床做出診斷并判斷疾病的嚴重程度。

（3）網織紅細胞的測定及臨床應用。目前，FCM檢測網織紅細胞主要用于預測骨髓移植的效果解釋各種紅細胞增長低下性貧血的發病原因，評價某些新的重組生物制劑的治療效果。

2.4 流式細胞儀在血栓與血小板相關疾病中的應用

血小板活化時其質膜糖蛋白較其靜止期發生顯著改變，FCM可以通過單抗免疫熒光標記監測血小板及活化情況。采用全血法測定，只需微量標本，在許多血小板相關疾病的診斷上有重要的臨床應用價值。

（1）血栓性疾病。動脈粥樣硬化前期血小板沉積，可導致心肌梗死和卒中(中風)，抗血小板藥能降低心肌缺血的發生率，證明心肌缺血與血小板活化有關。全血法FCM檢測表明心絞痛和心肌梗死患者循環系統中有活化的血小板.血小板活力也增強。冠狀竇血液的檢測表明，冠狀血管成形術會導致血小板活化。如果血流恢復后有高水平的活化血小板，血管可能因為內皮細胞嚴重損傷或血小板栓塞而發生再狹窄。因此，活化血小板的檢測能預測冠狀血管成形術后發生急性缺血事件的危險性。

（2）血小板缺陷性疾病。血小板缺陷性疾病如巨大血小板綜合征，它是由于GPlb—IX復合物先天缺陷所致的血小板形態巨大，功能異常的出血性疾病。巨大血小板從全血中分離很困難。FCM檢測能特異性地識別血小板，省去了分離巨大血小板的步驟，使檢測更簡便、精確。

（3）血小板減少性疾病。破壞過多或生成減少均能導致血小板減少。血小板相關抗體(PAIg)是反映血小板的破壞的指標，雖然其臨床意義仍有爭議。流式細胞儀用較少血量(1ml)的血液制備的血小板就能測定血小板上的PAIg平均水平。FCM還能測定其它一些反映血小板破壞的指標，如PAIgG、PAIgM、C3等。同時FCM能像檢測網織紅細胞那樣，檢測到循環中的“網織”血小板，來判斷血小板的生成。

2.5 流式細胞儀在腫瘤學中的應用

FCM已成為腫瘤學的主要研究手段之一，近年來已應用DNA倍體測定技術對多種實體瘤細胞進行研究。DNA含量直接代表細胞的倍體狀態，非倍體細胞與腫瘤惡性程度有關。

（1）發現癌前病變，協助腫瘤早期診斷。人體正常的體細胞均具有比較穩定的DNA二倍體含量。當人體發生癌變或具有惡性潛能的癌前病變時，細胞DNA含量可發生異常改變，DNA非整倍體出現率增高。FCM可精確定量DNA含量的改變。作為診斷癌前病變發展至癌變中的一個有價值的標志，FCM能對癌前病變的性質及發展趨勢作出估價，有助于癌變的早期診斷。

（2）腫瘤的診斷、預后判斷和治療中的作用。DNA非整倍體細胞峰的存在可為腫瘤診斷提供有力的依據。腫瘤細胞DNA倍體分析對病人預后的判斷有重要作用，異倍體腫瘤惡性病變的復發率高、轉移率高、死亡率也高，而二倍體及近二倍體腫瘤的預后則較好。FCM還可根據化療過程中腫瘤DNA分布直方圖的變化了解細胞周期細胞動力學變化，評估療效。

2.6 流式細胞儀在藥物學方面的應用

流式細胞儀在檢測藥物在細胞中的分布，研究藥物的作用機制方面應用廣泛。亦可用于篩選新藥，如化療藥物對腫瘤細胞的凋亡機制，可通過測DNA凋亡峰，Bcl-2凋亡調節蛋白等進行觀察。

綜上所述，FCM具有快速，靈敏及能同時進行多參數分析的優點，可以廣泛運用于從基礎研究到臨床實踐的各個方面，涵蓋細胞生物學、免疫學、血液學、腫瘤學、藥理學、遺傳學及臨床檢驗等多個領域。

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