云南白藥對(duì)豚鼠缺血心肌的保護(hù)作用

劉歆陽(yáng) 王智超 李曉丹 陸 燁 嚴(yán)鈺鋒

（1復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院07級(jí)臨床醫(yī)學(xué)八年制1班，醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心 上海 200032）

隨著生活質(zhì)量和醫(yī)療條件的改善，人類(lèi)壽命逐漸延長(zhǎng)，而老年疾病尤其是心血管病的病死率和死亡率也呈上升趨勢(shì)。根據(jù)我國(guó)流行病學(xué)調(diào)查，冠心病和腦卒中發(fā)病率與死亡率在增加，平均每年以5%的速度遞增［1］。在心血管疾病中，缺血性心肌病，包括粥樣硬化所導(dǎo)致的冠狀動(dòng)脈狹窄或梗阻，占有相當(dāng)大的比重，嚴(yán)重危害人群健康。

缺血性心肌病是中老年常見(jiàn)多發(fā)的后天性心臟病。舌下含服硝酸甘油可有效擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈，緩解心肌缺血性損傷，可作為急救藥品對(duì)家庭突發(fā)性缺血性心臟病有良好的保護(hù)作用。然而，對(duì)于沒(méi)有心血管疾病家族史的家庭，很少有儲(chǔ)備硝酸甘油。

云南白藥至今已有近百年歷史，其憑借良好的止血、活血化瘀、抗炎等作用被廣泛應(yīng)用于內(nèi)科、外科、婦科、兒科、五官科、皮膚科等多種疾病的治療［2］，為我國(guó)多數(shù)家庭常備藥。已有研究表明云南白藥的主要成分三七有改善心肌缺血的作用［3］，但云南白藥對(duì)心肌缺血的保護(hù)作用目前尚無(wú)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)研究云南白藥對(duì)心肌缺血的保護(hù)作用，探究云南白藥能否為家庭中突發(fā)性缺血性心臟病患者提供一種急救措施。

本研究應(yīng)用垂體后葉素復(fù)制豚鼠急性心肌缺血?jiǎng)游锬Ｐ停?］，以硝酸甘油干預(yù)為陽(yáng)性對(duì)照，以生理鹽水干預(yù)為陰性對(duì)照，通過(guò)比較心電圖改變、對(duì)比組織學(xué)改變和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變、對(duì)比大體缺血面積等方法研究云南白藥對(duì)心肌缺血的保護(hù)作用。

材料和方法

實(shí)驗(yàn)材料

試劑與儀器 豚鼠手術(shù)臺(tái)、哺乳動(dòng)物手術(shù)器械、豚鼠用心電圖生物轉(zhuǎn)換器、生物信號(hào)記錄儀、伊文氏藍(lán)（復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院功能學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供）；垂體后葉素、硝酸甘油（上海市第一生化制品有限公司）；云南白藥（云南省云南白藥有限公司）。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)豚鼠30只，雌雄不限，體質(zhì)量（400±30）g，由復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為5組，每組6只，分別是N組（正常組，生理鹽水對(duì)照）、ADH組（垂體后葉素腹腔注射造模）、NO組（造模后經(jīng)硝酸甘油解救）、LD組（造模后經(jīng)低濃度云南白解救）和HD組（造模后經(jīng)高濃度云南白藥解救）。

實(shí)驗(yàn)方法

模型建立與給藥劑量 豚鼠急性心肌缺血模型用腹腔注射0．5U／kg垂體后葉素建立。在心電圖出現(xiàn)心肌缺血表現(xiàn)后立即給予藥物解救。硝酸甘油和低濃度云南白藥給藥劑量由成人用藥量換算得到（以成人用藥量分別為5μg／kg，成人平均體質(zhì)量60 kg，人與豚鼠轉(zhuǎn)換系數(shù)5．55計(jì)算），分別為27．75 μg／kg和3．6mg／kg。高濃度云南白藥給藥量為36 mg／kg。兩種藥物均溶于生理鹽水，每只動(dòng)物注射總量為0．5mL。

蘇木精－伊紅切片染色 解救成功后即處死豚鼠，取出心臟。豚鼠心肌組織經(jīng)常規(guī)10%甲醛溶液固定，制成石蠟切片，蘇木精－伊紅染色后光鏡觀察。光鏡照片為同一視野下的400倍圖像。心肌染色組織切片由復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系協(xié)助制作。

心電圖分析 在注射垂體后葉素完成后開(kāi)始計(jì)時(shí)，心電圖在1min內(nèi)每15s記錄1次，1～5min之間，每30s記錄1次。記錄急性心肌缺血發(fā)生時(shí)間和持續(xù)長(zhǎng)短。正常豚鼠的ST段大多位于等電位線上，T波均為正向［5］，急性心肌缺血時(shí)心電圖形態(tài)的改變主要為ST段上移和T波高聳。急性心肌缺血心電圖出現(xiàn)時(shí)間和持續(xù)的長(zhǎng)短都是評(píng)價(jià)急性心肌缺血模型建立成功與否和藥物干預(yù)是否有效的特征性指標(biāo)［6］。起效時(shí)間定義為從注射硝酸甘油或云南白藥到心電圖恢復(fù)正常的時(shí)間。

心肌梗死面積計(jì)算 心電圖記錄完畢后立即處死豚鼠，去除心房組織及脂肪，將左心室心肌橫切4～5片，對(duì)心肌行TTC（伊文氏藍(lán)）染色，將心肌放入含有10g／L TTC的PBS（pH7．4）溶液中孵育10min。TTC染色區(qū)（深藍(lán)色）示仍存活的心肌組織，非TTC染色區(qū)（灰白色）即梗死區(qū)。拍照后將圖片由專(zhuān)人打亂編號(hào)，由另一位不知編號(hào)代表組別的分析人員勾畫(huà)染色區(qū)與非染色區(qū)以避免期望偏倚，用圖像分析軟件Photoshop可計(jì)算梗死區(qū)域所占面積百分比。

結(jié) 果

豚鼠心電圖分析 各組豚鼠心電圖表現(xiàn)見(jiàn)圖1ADH組豚鼠注射垂體后葉素后，心電圖出現(xiàn)T波抬高的心肌缺血表現(xiàn)，而N組無(wú)改變，提示造模成功。注入解救藥物后，NO組心肌缺血癥狀明顯緩解，T波回復(fù)正常，平均起效時(shí)間為（13．0±6．2）s。云南白藥解救組亦有解救效果，T波回復(fù)正常歷時(shí)較長(zhǎng)，低劑量組平均起效時(shí)間為（81．3±13．9s高劑量組平均起效時(shí)間為（46．0±14．0）s。差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05，圖2），提示云南白藥對(duì)急性心肌缺血具有解救作用且解救作用與劑量濃度正相關(guān)，但作用時(shí)間較硝酸甘油更長(zhǎng)。

圖1 各組心電圖表現(xiàn)Fig 1 ECG of each group

圖2 NO組、LD組、HD組對(duì)ADH的解救時(shí)間Fig 2 Resuce time for ADH of NO，LD and HD groups

豚鼠心肌梗死面積分析 各組平均值、方差及組間顯著性差異的檢驗(yàn)見(jiàn)圖3。N組與ADH組差異顯著表明急性心肌缺血模型建立成功，ADH組與NO組差異顯著提示硝酸甘油緩解心肌缺血效果明顯。ADH組與LD組及ADH組與HD組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），表明低劑量和高劑量云南白藥都能減少心肌梗死面積。NO組與LD組差異顯著表明LD組解救效果不及硝酸甘油，而NO組與LD組沒(méi)有顯著差異，則無(wú)證據(jù)表明硝酸甘油解救效果優(yōu)于高劑量云南白藥。TTC染色如圖4所示，灰白色即梗死區(qū)。

圖3 各組心肌缺血面積Fig 3 Ischemic area of each group

豚鼠心肌組織切片形態(tài)分析 N組：鏡下示心肌細(xì)胞呈短柱狀，彼此平行排列，核1～2個(gè)，卵圓形，居中；橫紋不明顯。ADH組：心肌纖維出現(xiàn)明顯腫脹，肌纖維排列稍顯紊亂并伴間質(zhì)水腫。部分區(qū)域心肌細(xì)胞腫脹，細(xì)胞核碎裂，有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。NO組：心肌細(xì)胞形態(tài)基本正常，排列較為規(guī)則，幾乎接近正常組織。LD組：心肌細(xì)胞水腫明顯，有少量壞死細(xì)胞與炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。HD組：心肌細(xì)胞水腫略有改善，壞死細(xì)胞較少（圖5）。

圖4 TTC染色顯示缺血區(qū)域Fig 4 Ischemic Area After TTC Treatment

圖5 各組心肌光鏡圖Fig 5 Micrographs of myocardia in each group

討 論

急性心肌缺血模型評(píng)價(jià) 經(jīng)注射垂體后葉素建模后，心電圖在短時(shí)間內(nèi)顯示為T(mén)波抬高；心肌組織出現(xiàn)明顯腫脹，排列紊亂伴間質(zhì)水腫的現(xiàn)象，同時(shí)心肌梗死面積比率顯著增大，與其他各組差異較大。功能學(xué)和形態(tài)學(xué)的指標(biāo)與心肌缺血時(shí)的病理狀態(tài)相吻合，提示心肌缺血模型建立成功。

陽(yáng)性對(duì)照效果評(píng)價(jià) NO組的心肌缺血型心電圖在短時(shí)間內(nèi)緩解，且組織形態(tài)學(xué)上顯示心肌細(xì)胞形態(tài)和排列與N組相似，與ADH組差異較大，提示硝酸甘油對(duì)于急性心肌缺血的解救效果明顯。

硝酸甘油為臨床急性心肌缺血解救的常用藥，其療效得到了理論和實(shí)踐的長(zhǎng)期印證，效果顯著，本實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用硝酸甘油對(duì)于急性心肌缺血解救的效果作為陽(yáng)性對(duì)照，評(píng)價(jià)云南白藥的解救作用。

云南白藥對(duì)急性心肌缺血的保護(hù)作用 通過(guò)LD組、HD組和ADH組的比較，功能學(xué)和形態(tài)學(xué)的指標(biāo)都提示云南白藥對(duì)于急性心肌缺血有潛在的解救作用。HD組的解救作用在起效快慢、保護(hù)作用大小方面都明顯優(yōu)于LD組，提示云南白藥對(duì)于急性心肌缺血的解救作用有一定的劑效正相關(guān)。LD組和HD組的解救效果都低于陽(yáng)性對(duì)照，說(shuō)明云南白藥在這兩個(gè)濃度的解救效果都弱于硝酸甘油。

本實(shí)驗(yàn)采用的給藥方式是腹腔注射，與云南白藥常用的口服和外用方式不同。但在醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，只要給藥劑量換算正確，不同的給藥方式在效果方面是等效的。本實(shí)驗(yàn)以豚鼠為對(duì)象，且心肌缺血過(guò)程變化迅速，另外實(shí)驗(yàn)中需監(jiān)測(cè)豚鼠的心電圖，靜脈注射、口服或外用存在需要移動(dòng)體位，吸收較慢，創(chuàng)傷性操作，操作復(fù)雜等缺點(diǎn)，對(duì)心電圖干擾較大，會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判斷。而腹腔注射能夠快速微創(chuàng)傷性給藥，無(wú)需移動(dòng)豚鼠體位，藥物起效快。有文獻(xiàn)證實(shí)［5，7］，針對(duì)豚鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象的研究包括藥理學(xué)、藥效學(xué)、心血管疾病治療方面的研究，多采用腹腔注射的給藥途徑，并能夠得到公認(rèn)。所以，本實(shí)驗(yàn)腹腔注射得到的結(jié)論是可信的。

本實(shí)驗(yàn)中云南白藥選用了高低兩個(gè)劑量，其中低劑量由成人正常劑量換算得到。目前對(duì)于云南白藥的不良反應(yīng)及劑量報(bào)道較少，有報(bào)道稱(chēng)高劑量口服云南白藥會(huì)導(dǎo)致房室傳導(dǎo)阻滯，但僅為少數(shù)病例［8］，缺少對(duì)其他各種影響因素的全面分析，機(jī)制闡述不清。由于云南白藥沒(méi)有公認(rèn)的治療窗，高劑量粗略定為低劑量的10倍，旨在研究云南白藥對(duì)心肌缺血的保護(hù)作用是否有劑量依賴關(guān)系及超大劑量云南白藥是否有明顯的毒性作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，10倍劑量的云南白藥給藥后短期內(nèi)未發(fā)現(xiàn)明顯不良反應(yīng)。云南白藥治療心肌缺血的最佳濃度及安全的治療窗有待于進(jìn)一步設(shè)計(jì)濃度梯度實(shí)驗(yàn)探究。

云南白藥解救心肌缺血的作用機(jī)制目前還不明確，有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明云南白藥能增加心肌營(yíng)養(yǎng)性血流［9］。臨床研究發(fā)現(xiàn)在非血運(yùn)重建急性Q波心肌梗死伴有室壁瘤的患者中，云南白藥可降低患者血清白介素－6、白介素－8和高敏C反應(yīng)蛋白等炎性介質(zhì)的水平［10］。另外，云南白藥的主要成分三七中的三七總皂苷有抗血栓形成、改善微循環(huán)、降低心肌耗氧量和減輕再灌注損傷等功能［3］。但云南白藥中各種有效成分如何相互作用、是否協(xié)同對(duì)抗心肌缺血等問(wèn)題還有待進(jìn)一步研究。

致謝 復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系張志剛老師以及功能學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)室的各位老師在整個(gè)項(xiàng)目的進(jìn)展過(guò)程中給予了幫助與支持。

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