谷氨酸介導三氧化二砷抑制SHG-44膠質瘤細胞增殖

孫桂亮 張承巍 李若文 徐海艷 崔大勇 魯質成

(吉林大學第二醫院，吉林 長春 130041)

谷氨酸(Glu)是中樞興奮性遞質，可以營養神經、促使神經元細胞的生長發育及軸突生長，但是過量可以引起細胞死亡。有研究表明(As2O3)可以誘導細胞凋亡、阻斷細胞周期、降低線粒體的膜內外電位差以及增加P53蛋白的表達，達到抑制腫瘤的作用〔1～3〕。本研究針對Glu在As2O3抑制SHG-44膠質瘤細胞增殖中是否發揮作用展開研究，為As2O3抗腦內膠質瘤的作用增加實驗依據。

1 材料與方法

1.1 細胞培養 將SHG-44膠質瘤細胞從－80℃冰箱中取出，進行細胞復蘇、傳代。觀察細胞在對數生長期長滿后，進行臺盼藍染色排斥試驗活性測定，然后用PBS緩沖液制成細胞懸液。

1.2 Glu測定 將SHG-44膠質瘤細胞配制成濃度為1×105個/ml，接種于6孔板中，加入新培養液后，放入孵箱中，5%CO2、37℃條件下孵育24 h，分別在各個孔中加入濃度分別為 0、1、2、4、8 μmol/L 的 As2O3，然后分別在加藥后的 24、48、72 h使用CMA600微透析分析儀，根據微透析操作說明微量分析各組細胞液中Glu的濃度。

1.3 流式細胞技術測定氧自由基(ROS)的變化 將接種于24孔板(1 ×105/孔)的膠質瘤細胞，分別加入 0、1、2、4、8 μmol/L As2O3，在孵箱孵育24、48、72 h 后每孔加入 50 μmol/L 熒光試劑1 ml，孵箱孵育30 min。吸出含熒光試劑的培養基，胰酶消化、離心、清洗細胞。使用FACS Calibur型美國B-D公司生產的流式細胞儀，激發光488 nm，發射光525 nm，檢測1×104個細胞。

1.4 統計學方法 采用SPSS15.0軟件，采用 One-Way ANO-VA方差分析。

2 結果

2.1 不同濃度As2O3作用于SHG-44膠質瘤細胞后Glu濃度的變化 與未使用As2O3(0 μmol/L)的SHG-44膠質瘤細胞相比，隨作用時間的延長及作用濃度的增加，Glu濃度也逐漸增加(P ＜0.05)，見表1。

表1 不同濃度As2O3作用于SHG-44膠質瘤細胞后Glu濃度變化( s，μmol/L)

表1 不同濃度As2O3作用于SHG-44膠質瘤細胞后Glu濃度變化( s，μmol/L)

與0 μmol/L 組比較:1)P ＜0.05;下表同

As2O3(μmol/L)24 h 48 h 72 h 0 39.87±1.13 39.54±1.4 40.51±0.98 1 50.9±0.981) 73.68±1.451) 103.51±1.171)2 81.48±1.231) 118.47±1.451) 160.48±0.851)4 128.57±1.231) 167.88±1.391) 227.02±1.091)8 170.48±1.411) 220.4±1.261) 294.68±1.341)

2.2 不同濃度As2O3作用于SHG-44膠質瘤細胞后ROS的變化 As2O3作用24、48 h后1 μmol/L組與未使用As2O3組無明顯差異(P＞0.05)，As2O3作用72 h后1 μmol/L組細胞內 ROS高于未使用 As2O3組(P ＜0.05);而 2、4、8 μmol/L 組，細胞染色比例隨As2O3作用時間的延長及作用濃度的增加，細胞內ROS增加(P ＜0.05)，見表2。

表2 As2O3作用于SHG-44膠質瘤細胞DCF染色比的變化( s，%)

表2 As2O3作用于SHG-44膠質瘤細胞DCF染色比的變化( s，%)

As2O3(μmol/L)24 h 48 h 72 h 0 0.52±01.3 0.54±0.3 0.51±0.28 1 0.59±0.28 0.62±0.4 1.31±0.371)2 1.48±0.231) 2.91±0.381) 4.48±0.451)4 3.57±0.31) 4.82±0.411) 7.02±1.011)8 7.48±1.011) 9.45±1.061) 12.28±1.281)

3 討論

Glu多數存在于細胞內，濃度可達細胞外的數千倍。腦脊液中的Glu通過α-酮戊二酸途徑及谷氨酰胺途徑生成。Glu的釋放依賴于細胞膜的胱氨酸-谷氨酸交換體——Xc系統，該轉運體將一分子Glu轉運到到細胞外的同時，也轉運一分子的胱氨酸進入細胞內，二者相互偶聯進行轉運。進入到細胞內的胱氨酸，在還原酶的作用下生成半胱氨酸，半胱氨酸可以:①參與谷胱甘肽(GSH)的合成，GSH為重要的自由基清除劑;②擴散出細胞后再次生成胱氨酸，參與下一次的谷氨酸-胱氨酸轉運。當細胞外的Glu升高時，細胞內外Glu的濃度倒置，導致Glu轉運方向轉為逆向，胱氨酸進入細胞的轉運被阻滯，引起細胞內GSH的合成減少〔4〕，使重要的自由基清除劑——GSH的抗氧化應激損傷能力下降，造成細胞內的ROS大量蓄積，氧自由基攻擊位于細胞內的一些超微結構，特別是線粒體，出現一系列的生理生化反應，引起細胞的損傷甚至死亡。

對于膠質瘤細胞來講，細胞外Glu的濃度升高是瘤體細胞生長以及遷移所必需的內環境〔5～7〕，而在使用As2O3后，細胞外Glu的濃度進一步升高可能是因為As2O3與線粒體膜上腺苷酸轉運體結合，作用于蛋白分子中的巰基，使其空間位置上相鄰的兩個巰基最后形成了二硫鍵，導致線粒體膜PTP的開放，進而引起線粒體膜電位下降〔8〕，引起SHG-膠質瘤細胞產生內源性的ROS數量明顯增多，該細胞通過增加細胞內GSH的含量來抗細胞內氧化應激帶來的損傷，導致Xc系統過度轉運，細胞外Glu濃度升高，而過度增多的谷氨酸，導致谷氨酸逆向轉運，細胞內胱氨酸減少，GSH合成的原材料的減少以及細胞內增多的ROS引起細胞內GSH逐漸耗竭，細胞抗氧化應激的能力下降，細胞出現功能障礙甚至死亡。

由此可見，As2O3在體外抑制腦內SHG-44膠質瘤細胞的增殖來源于Glu增多，促進了細胞內GSH耗竭而引起細胞內氧化應激的加強，導致細胞的死亡。

1 Chen B，Cao F，Yuan C，et al.Arsenic speciation in saliva of acute promyelocytic leukemia patients undergoing arsenic trioxide treatment〔J〕.Anal Bioanal Chem，2013;405(6):1903-11.

2 Yanada M，Tsuzuki M，Fujita H，et al.Phase 2 study of arsenic trioxide followed by autologous hematopoietic cell transplantation for relapsed acute promyelocytic leukemia〔J〕.Blood，2013;121(16):3095-102.

3 Kim J，Aftab BT，Tang JY，et al.Itraconazole and arsenic trioxide inhibit Hedgehog pathway activation and tumor growth associated with acquired resistance to smoothened antagonists〔J〕.Cancer Cell，2013;23(1):23-34.

4 Bridges R，Lutgen V，Lobner D，et al.Thinking outside the cleft to understand synaptic activity:contribution of the cystine-glutamate antiporter(System xc-)to normal and pathological glutamatergic signaling〔J〕.Pharmacol Rev，2012;64(3):780-802.

5 Ciceroni C，Bonelli M，Mastrantoni E，et al.Type-3 metabotropic glutamate receptors regulate chemoresistance in glioma stem cells，and their levels are inversely related to survival in patients with malignant gliomas〔J〕.Cell Death Differ，2013;20(3):396-407.

6 Oh MC，Kim JM，Safaee M，et al.Overexpression of calcium-permeable glutamate receptors in glioblastoma derived brain tumor initiating cells〔J〕.PLoS One，2012;7(10):e47846.

7 Lazovic J，Soto H，Piccioni D，et al.Detection of 2-hydroxyglutaric acid in vivo by proton magnetic resonance spectroscopy in U87 glioma cells overexpressing isocitrate dehydrogenase-1 mutation〔J〕.Neurol Oncol，2012;14(12):1465-72.

8 Jia P，Chen G，Huang X，et al.Arsenic trioxide induces multiple myeloma cell apoptosis via disruption of mitochondrial transmembrane potentials and activation of caspase-3〔J〕.Chin Med J(Engl)，2001;114(1):19-24.