采用基因芯片技術研究黃芪對衰老小鼠腦組織基因表達的影響

明海霞 賀志有 王香梅 王 嵐 侯 茜 張 帆 (甘肅中醫學院，甘肅 蘭州 730001)

近年來，對黃芪影響衰老相關基因、細胞凋亡、DNA損傷的修復及端粒長度來延緩衰老的研究有所進展〔1〕。郝春光等〔2〕運用RT-PCR技術，研究黃芪對快速老化鼠相關衰老基因表達的影響。這些研究方法，多以單一或少量幾個靶點的生物信息改變為研究對象，對中藥多組分、多靶點、多途徑的作用特點，上述研究方法，則顯露出明顯的局限性，對此基因芯片技術卻是有益的補充。基因芯片技術具有高通量、并行性、低消耗、微型化和自動化的特點，能夠高效、快速且多參量同時研究大量基因在不同刺激條件下表達的差異〔3〕。鑒于基因在衰老過程中的重要性及中藥作用的整體效應，本研究采用D-半乳糖所致衰老模型小鼠，小鼠全基因組基因芯片，研究甘肅黃芪對衰老模型小鼠腦組織基因表達譜的影響。

1 材料與方法

1.1 藥物制備 黃芪水煎劑的制備:取黃芪100 g(甘肅岷縣黃芪，經甘肅中醫學院中藥系教授張西玲鑒定)，切成片，加相當于藥材量8倍的冷水浸泡2 h，煮沸30 min，濾過;藥渣加6倍量水煮沸20 min，濾過。合并兩次煎出液，加熱濃縮至100 ml，即為100%黃芪水煎劑，其濃度相當于生藥量1 g/ml，置4℃備用〔4〕。

1.2 試劑與儀器 D-半乳糖購自北京索萊寶科技有限公司(產品編號D810-25);TRIzol(Invitrogen);RNasey Mini Kit(Qiagenp/n 74904);Baseline-ZERO Dnase (EPICENTRE，Cat.Nos.DB0711K);Agilent Gene Expression Hybridization Kit(Agilent p/n 5188-5242);NanoDrop ND-1000;Hybridization oven(Agilent p/n G2545A)Slide-staining dish，with sliderack(Thermo Shandon p/n 121);包含41000個基因的Agilent小鼠全基因組表達譜芯片(Agilent Whole Mouse Genome Oligo Microarray 4×44K)Agilent Microarray Scanner(Agilent p/n G2565BA)。

1.3 造模及分組 昆明種小鼠30只，2～3月齡，體重18～22 g，雌性，由甘肅中醫學院動物中心提供，SPF級。適應性喂養1 w后，分籠群養，自由飲水、攝食，自然光照，室溫20℃ ～25℃，濕度45% ～55%。隨機分為3組，空白組、模型組、黃芪組，每組10只。除空白組外，其余各組每只頸背皮下注射5%D-半乳糖120 mg·kg－1·d－1，連續 6 w〔4〕，造成衰老模型。空白組頸背皮下注射同等劑量生理鹽水。造模的同時，空白組和模型組每只每天灌服生理鹽水0.5 ml，黃芪組小鼠按黃芪煎液18 g·kg－1·d－1灌胃 (相當于 60 kg的成人臨床最大用量的12倍)。

1.4 標本制備 連續給藥6 w后，于最后1 d灌胃和注射D-半乳糖2 h后，頸椎脫臼處死，立即取出腦組織，切取海馬區組織50～100 mg加入1 ml的TRIzol試劑用玻璃勻漿器勻漿，置－20℃冰箱備用。同時取肝組織測定超氧化物歧化酶(SOD)，丙二醛(MDA)，谷胱苷肽過氧化物酶(GSH-Px)，方法按試劑盒說明進行(測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所)。

1.5 總RNA提取、純化 按Trizol(Invitrogen life technologies)法提取腦組織細胞中的總RNA，通過異丙醇沉淀法濃縮RNA，并進一步采用QIAGEN RNase試劑盒純化總RNA，詳細操作方法按試劑盒說明，最后用分光光度計定量，甲醛變性膠電泳質檢。基因芯片試驗，由上海康成生物完成。

1.6 掃描與分析 芯片掃描用美國安捷倫公司的基因芯片掃描儀，單色掃描，芯片數據通過安捷倫公司的影像分析轉換軟件(版本號10.5.1.1)把圖像信號轉化為數字信號，再通過GeneSpring GX軟件(版本號10.0)進行后期數據處理。數據用Lowess方法進行歸一化;最后以差異為2倍的標準來確定差異表達基因。

2 結果

2.1 抗衰老小鼠模型的構建 造模2 w后，模型組小鼠開始出現精神萎靡、食量下降、行動遲緩、毛發枯黃、失去光澤、皮膚松弛彈性下降等一系列的衰老癥狀，而藥物組、空白組則精神狀態良好、行動敏捷、毛色白、光滑、皮膚彈性良好。經過7 w的造模后這些癥狀更加明顯。與空白組比較，衰老模型組小鼠肝中MDA含量明顯增加，SOD、GSH-Px活性明顯降低;與模型組比較，黃芪組小鼠肝臟組織中MDA含量顯著降低(P＜0.01)，肝臟SOD活力和GSH-Px活力明顯增高(P＜0.01);表明黃芪水煎劑能顯著增高衰老小鼠肝臟中SOD、GSH-PX活力和降低MDA含量，有明顯抗氧化作用，根據文獻報道說明此次造模是成功的〔5〕。見表1。

表1 黃芪水煎劑對小鼠肝組織SOD，MDA，GSH-Px的影響( s，n=10)

表1 黃芪水煎劑對小鼠肝組織SOD，MDA，GSH-Px的影響( s，n=10)

與模型組比較:1)P＜0.01

組別SOD(U/mg)MDA(nmol/mg)GSH-Px(活力單位)空白組 128.55±23.851) 5.68±2.271) 33.62±8.651)模型組 100.09±19.69 10.98 ±3.81 21.65 ±8.92黃芪組 129.41±20.651) 3.84±1.571) 34.29 ±7.801)

2.2 不同組小鼠腦組織總RNA提取、純化質量的檢測結果變性瓊脂糖凝膠電泳，紫外透射光下觀察并拍照，結果顯示(圖1)，28 S和18 S核糖體RNA的帶非常亮而濃，兩個條帶間的亮度之比基本符合2∶1。還觀察到一個更小稍微擴散的帶，它由低分子量的RNA(tRNA和5S核糖體RNA)組成。在18S和28S核糖體帶之間一般可以看到一片彌散的EB染色物質，可能是由mRNA和其他異型RNA組成。

用紫外分光光度計測定260 nm、280 nm和230 nm的吸光度(OD)值，通過計算得出:(1)OD260/OD280＞1.96，說明蛋白質污染極少;(2)OD260/OD230＞1.97，說明異硫氰酸胍等鹽類污染極少;(3)按照1OD260=40 μg RNA/ml計算，各組總體RNA產率接近，大約都在2 μg RNA/mg組織。從照片和OD值分析，所得總體RNA的純度和完整性均較好，適宜進行mRNA純化及雜交分析。

2.3 芯片掃描圖 根據實驗要求對所提取的3組小鼠腦組織RNA樣品在3張包含41 000個基因的Agilent小鼠全基因組表達譜芯片(Agilent Whole Mouse Genome OligoMicroarray 4×44 K)上分別進行雜交后，基因芯片掃描圖如下(圖2，本試驗為單色Cy3標記)每一個點代表一個基因的表達，亮度越高就代表表達量越高，不同位置代表不同探針。根據不同的亮度顯示應用專業的掃描軟件進行表達量的對比，篩選出差異基因。右側上圖是芯片左上角、下圖是中間部分掃描圖的放大。

2.4 差異表達基因的分析 黃芪組與模型組比較有3 744個差異表達基因，其中2 235個表達上調，1 509個表達下調;黃芪組與空白組比較有2 771個差異表達基因，其中1 576個表達上調，1 195個表達下調;模型組與空白組比較有924個差異表達基因，其中454個表達上調，470個表達下調。

通過比較分析模型組與空白組、黃芪組與空白組、黃芪組與模型組差異表達的基因，獲得在衰老小鼠中，表達水平受黃芪用藥影響的基因。對模型組與空白組比較，篩選出29個基因，其中未知基因14個，已知基因15個，上調基因5個，下調基因10個。這15個基因，在黃芪組中有4個表達與模型組一致，11個表達有顯著差異。見表2。

表2 與空白組比較在模型組和黃芪組表達有顯著差異的部分基因列表

對黃芪組與空白組比較，另外篩選出21個只在黃芪組表達的基因，其中未知基因8個，已知基因13個，上調基因9個，下調基因4個〔6〕。見表3。

表3 只在黃芪組表達的部分差異基因列表

3 討論

本文篩選出15個與衰老相關的基因，其中4個在黃芪組與模型組表達一致，11個表達有顯著差異，另外，篩選出13個只在黃芪組中有明顯表達差異的基因，這些基因與衰老沒有直接的相關性，但可能與黃芪延緩衰老的作用機制有關〔7，8〕。

在本實驗中，與衰老有關的15個基因參與的生物學過程，主要有:細胞的代謝過程，免疫應答，生物大分子的修飾，蛋白質的磷酸化，蛋白質的運輸，DNA的轉錄，對DNA損傷的應答，細胞的生物合成，離子的跨膜轉運，細胞骨架，細胞連接，神經原細胞突軸的發育;細胞通訊，神經沖動的傳導，中樞神經系統的發育，髓鞘的形成，神經細胞的分化、凋亡等;表明經D-半乳糖作用后，小鼠表現出以上生物學功能的衰退。經黃芪治療后，涉及以上生物學過程的基因表達發生改變，表明黃芪對衰老治療的機制可能是通過干預衰老相關基因表達的調控進行的。另外，通過黃芪組與空白組比較，篩選出13個只在黃芪組中有明顯表達差異的基因，這些基因與衰老沒有直接的相關性，但它們涉及以下生物學功能:細胞內的信號轉導，核酸的生物合成，DNA損傷的修復，抑制神經細胞的凋亡，微管的形成，促進細胞的代謝活動，促進細胞的信號傳導，參與神經元的分化及發育，腦的發育等生物學過程，這些基因在黃芪組與空白組中表達有明顯差異，而在模型組沒有表達，我們認為，黃芪可能通過對這些基因表達的調控，延緩衰老。從延緩衰老的基因水平現有研究進展來看，延緩衰老作用并非是作用于單一基因，而是一極其復雜的生物過程，是一連串基因激活與阻抑，通過各自產物相互作用，與內、外環境交互影響的結果。這些研究從不同角度提出了延緩衰老的機制，但是對于延緩衰老來說所要解決的問題還很多，需要我們在現有研究的基礎上多途徑，多角度地探索。

本文結果表明黃芪通過多途徑、多層次、多靶點的整體調整作用，改善DNA修復功能，糾正凋亡調控機制的紊亂，促進組織的修復，同時改善了信號的傳遞，并從基因轉錄水平反映了黃芪的整體良性調整作用。對于這些基因與衰老程度的關系以及和黃芪用藥的線性關系的進一步深入研究，還需定量PCR技術進一步檢測，給出定量關系，為揭示黃芪抗衰老的作用機制奠定基礎。

1 李 靜，陳 超.黃芪抗衰老作用分子機制的研究進展〔J〕.中國現代藥物應用，2008;2(2):92-3.

2 郝春光，徐 丹，習楊彥彬，等.黃芪抗腦衰老作用的研究〔J〕.解剖科學進展，2008;14(1):47-50.

3 葉 芳，苑偉政.基于基因表達譜芯片的人參對衰老腦組織作用研究〔J〕.西北工業大學學報，2006;24(5):667-71.

4 李儀奎，金若敏，王欽茂，等.中藥藥理實驗方法學〔M〕.第2版.上海:上海科學技術出版社，2006:119.

5 張 熙，李文彬，張炳烈.D-半乳糖亞急性中毒大鼠擬衰老生化改變〔J〕.中國藥理學與毒理學雜志，1990;4(4):309-10.

6 余榕捷，蒲含林.利用基因芯片研究六味地黃丸對老年大鼠基因表達的影響〔J〕.中國病理生理雜志，2004;20(2):260-5.

7 楊裕華，李 震.金匱腎氣丸、右歸丸對腎陽虛小鼠模型以藥反證的腦基因芯片研究〔J〕.中國中藥雜志，2009;34(9):1124-8.

8 賈 鵬，張 平，于小華，等.黃芪甲甙干預大鼠肺纖維化相關基因的時空表達〔J〕.現代生物醫學進展，2010;10(7):1227-31.