7種半胱氨酸蛋白酶抑制劑C檢測系統的分析性能評價

安崇文， 李海霞

(北京大學第一醫院檢驗科，北京100034)

近年來，國內外研究表明半胱氨酸蛋白酶抑制劑C(cystatin C，Cys C)已經成為反映腎小球濾過率功能受損的一個較理想的早期標志物［1-2］。目前Cys C檢測系統較多，檢測原理不盡相同。美國病理學家協會(CAP)室間質評結果顯示Cys C檢測存在差異性較大，2011和2012年度所有參加實驗室的變異系數(CV)為13.3%～30.7%，且采用歐洲標準物質(ERM-DA471)進行的正確度評價未見報道。因此，我們對目前國內常用檢測系統［包括5個顆粒增強膠乳透射免疫比濁法(particle-enhanced latex turbidimetric immunoassay，PETIA)檢測系統、1個顆粒增強聚苯乙烯散射免疫比濁法(particle-enhanced polystyrene nephelometric immunoassay，PENIA)檢測系統、1個膠體金均相溶膠顆粒免疫(colloidal gold homogeneous sol particle immunoassay，SPIA)檢測系統］進行評價，分析其精密度、空白限(LoB)、抗干擾性以及正確度驗證等性能，證實其是否能滿足預期臨床用途。

材料和方法

一、儀器試劑與樣本準備

1.檢測系統 5個PETIA檢測系統和1個SPIA檢測系統以A～F表示，PENIA檢測系統簡稱為BNⅡ系統。各檢測系統試劑、校準液批號見表1。

表1 檢測系統來源詳情

2.儀器 5個PETIA檢測系統(A～E系統)和1個SPIA檢測系統(F系統)均采用HITACHI 7600-110全自動生化分析儀，PENIA檢測系統應用SIEMENS DADE BEHRING BNⅡ特定蛋白分析儀。

3.比對樣本 選取患者樣本46份，其Cys C濃度覆蓋整個可報告范圍，標本無黃疸、溶血、乳糜等干擾。

4.輔助試劑 生理鹽水來自北京雙鶴藥業股份有限公司生產的0.9%氯化鈉注射液(批號1107014W)，用于基礎空白測定和稀釋樣本;干擾物質血紅蛋白(Hb)自配，將新鮮乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝全血離心，去除血漿，加生理鹽水洗滌紅細胞，重復3次，再加去離子純水使之溶血，配制成Hb干擾物;醫用脂肪乳(C14-24)由西安力邦制藥有限公司提供(批號:11080S)，用生理鹽水稀釋成甘油三酯(TG)濃度為4、8、15、28 mmol/L的干擾物。

二、評價方法

參考美國臨床實驗室標準化協會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)評價方案對檢測系統性能進行評價。

1.精密度評估 參考CLSI EP5-A2文件［3］。選取患者新鮮血清，自行配制3個濃度(0.8、2.7、4.7 mg/L)的混合血清。批內重復性:同一時間內連續測定20次。批間重復性:連續測定10 d，每天測定2批，每批測定1次，2批間隔＞2 h。計算批內、批間變異系數(CV)。根據美國臨床實驗室修正法案(CLIA'88)建議:批內CV＜1/4總允許誤差(TEa)(即＜3.75%)，批間 CV＜1/3 TEa(即＜5%)［4-5］;基于 CLIA'88 對生物學變異設定的分析質量指標中建議Cys C的精密度應達到的理想目標為2.3%［6-8］。

2.正確度評估 參考 CLSI EP15-A2文件［9］。方法①:對歐洲Cys C有證參考物質ERMDA471/IFCC［其靶值±不確定度為(5.48±0.15)mg/L］進行檢測，分析與靶值之間的偏倚;方法②:對2011年度和2012年3月CAP發放的Cys C室間質評物進行測定。根據CLIA'88建議，TEa＜±15%［4-5］，基于 CLIA'88對生物學變異設定的分析質量指標中建議Cys C的偏倚和TEa應達到的理想目標分別為3.4%和7.2%［6-8］。

3.空白限(LoB) 參考 CLSI EP17-A文件［10］。以生理鹽水作為空白樣本，每天檢測2批，每批重復2次，連續5 d，共獲得20個結果。將實驗數據繪制成頻數分布圖，根據其分布類型再采用參數檢驗或非參數檢驗方法估計LoB。

4.抗干擾性評估 參考 CLSI EP7-A2文件［11］。收集低(0.8 mg/L)、高(7.3 mg/L)2 個濃度混合血清，在上述血清中加入Hb、TG干擾物，配制成Hb終濃度為10、13 g/L，TG終濃度為4、8、15、28 mmol/L的樣本，對照樣本加入等體積生理鹽水，每份樣本測定2次，取均值，以偏差＜±10%作為評判標準。

5.相關和偏差分析 參考CLSI EP9-A2文件［12］。各系統同時測定，每份樣本測定2次，取均值，以BNⅡ系統(PENIA)為參考，分析PETIA與PENIA間的相關性和偏差。相關系數(r)要求＞0.975。

三、統計學方法

統計學分析采用Microsoft Excel 2003、SPSS 13.0 及 Medcalc 11.6.1 軟件。相關性分析采用Pearson相關，P＜0.05為差異有統計學意義。偏差分析應用Bland-Altman差異分析法。

結 果

一、精密度評估結果

當Cys C 濃度為0.8～5.0 mg/L時，6個系統(A～F)和BNⅡ系統總批內CV均＜3.75%，總批間CV除E系統外均＜5%，重復性良好;其中D系統的精密度符合CLIA'88建議的理想目標(CV＜2.3%)。見表2、3。

二、正確度評估結果

1.A～E系統和BNⅡ系統測定ERM-DA471的絕對偏倚分別為0.00、0.00、1.01、－0.01、－0.50、－0.35 mg/L，相對偏倚分別為0%、0%、18.43%、－0.18%、－9.12%、－6.39%;F 系統未參與評估。其中A、B、D 3個系統符合CLIA'88建議達到的理想偏倚(3.4%)［6-8］。見表4。

表2 6個檢測系統(A～F)和BNⅡ系統的批內精密度(%)

表3 6個檢測系統(A～F)和BNⅡ系統的批間精密度(%)

表4 A～E系統和BNⅡ系統測定ERM-DA471的結果

2.僅D系統和BNⅡ系統測定CAP室間質評物的結果較為理想，滿足CLIA'88建議的理想目標(TEa＜7.2%)［6-8］，其他系統均有 50% 的結果與CAP均值的相對偏倚超出CLIA'88建議的TEa(靶值±15%)。整體來看，PENIA測定結果低于PETIA。見表5。

三、空白限(LoB)實驗結果

A～F系統和BNⅡ系統的LoB分別為0.00、0.00、0.31、0.01、0.10、0.06和＜0.05 mg/L。

四、抗干擾性驗證結果

當Hb≤13 g/L、TG≤28 mmol/L時對A、B系統及BNⅡ系統無影響(干擾＜±10%)。C系統在TG≥4 mmol/L時呈正干擾;D系統在TG≥28 mmol/L時對低水平Cys C呈負干擾;E系統在Hb≥10 g/L時對低水平Cys C呈負干擾;F系統在Hb≥10 g/L時對低水平Cys C呈正干擾，在TG≥15 mmol/L時對低水平Cys C呈負干擾。見表6。

表5 6個檢測系統(A～F)和BNⅡ系統測定CAP室間質評物的結果 (mg/L)

表6 6個(A～F)檢測系統和BNⅡ系統抗干擾性驗證結果 (mg/L)

五、相關性和偏差分析

A～F系統與BNⅡ系統的相關性較好，r分別為0.998、0.998、0.986、0.998、0.994、0.993，均＞0.975(P＜0.01)。Bland-Altman偏差分析顯示A～F系統與BNⅡ系統的平均絕對偏差分別為－0.02、－0.10、－0.31、0.05、0.04、0.36 mg/L，平均百分偏差分別為－0.57%、2.58%、10.15%、4.92%、14.48%、8.06%。見圖1。

圖1 A～F系統與BNⅡ系統的偏差分析

討 論

目前國內Cys C測定方法多種多樣，原理各不相同。不同體系間的偏差導致以Cys C作為參數估算腎小球率過濾(eGFR)的方程多樣性，這是由于測定Cys C的校準品不同，方法未一致化所造成的。因此Cys C的標準化問題受到高度重視，國際臨床化學和實驗室醫學聯盟(IFCC)成立了Cys C標準化工作組，工作組推薦將Cys C原級參考品添加到脫脂的人血清中，制備得到的次級標準物質(ERM-DA471/IFCC)具有良好的互通性。ERM-DA471在復溶物質中使用顆粒增強膠乳散射比濁、顆粒增強膠乳透射比濁和酶促單向免疫擴散3種方法來定量，有Dako、Roche Diagnostics、Siemens Healthcare Diagnostics 3 個檢測系統參與。該定值由4個實驗室各自檢測，由7個可接受均值的未加權均值確定。目前在國內各系統之間測定ERM-DA471的正確度評估未見報道，國產Cys C試劑校準品溯源不統一，校準品賦值存在差異。為此，本研究選取國內常見6種檢測系統在HITACHI系統進行分析性能驗證，以期為臨床應用提供信息。

正確度驗證顯示不同檢測系統之間存在著差異，測定ERM-DA471顯示PETIA法中 A、B、D 3個系統在可接受范圍，而C、E、BNⅡ系統均超出規定的不確定度，最大偏倚可達到1 mg/L，最大相對偏倚為18.43%，準確性欠佳。檢測系統的性能需要進一步改進。為進一步評價不同儀器檢測系統間是否存在差異，我們對CAP室間質控物進行分析，其靶值統計是采用所有參與實驗室按方法學或儀器分組計算中位數求得。按檢測儀器不同分為HITACHI/ROCHE全自動生化儀系列和SIEMENS特種蛋白儀系列，結果顯示采用HITACHI系列PETIA中僅D系統符合CLIA'88建議的理想TEa(7.2%)，SPIA也未能滿足要求;BNⅡ系統測定CAP質控物偏倚雖然也在TEa(7.2%)允許范圍內，但是其不同水平的測定結果均低于HITACHI/ROCHE系列檢測系統。

抗干擾性驗證顯示C系統在TG≥4 mmol/L時對低水平和高水平樣本均呈正干擾(干擾＞+10%)，可能與C系統使用單波長測定有關，使用單波長雖可提高檢測靈敏度，但不能消除脂血、乳糜帶來的濁度影響，建議C系統在測定脂血和乳糜血標本時增加第2波長;F系統在Hb≥10 g/L時對低水平樣本呈正干擾(干擾＞+10%)，Hb≥13g/L時對高水平樣本呈正干擾(干擾＞+10%)，考慮F系統是采用SPIA，其反應體系顏色的變化會影響Cys C的檢測，因此溶血對樣本測定影響較大。

6個系統(A～F)與BNⅡ系統相關性良好(r均＞0.975，P＜0.01)。Bland-Altman 差異分析顯示6個系統(A～F)與BNⅡ系統之間的平均偏差和平均百分偏差相差較大，與文獻［13］報道相符，其中C系統與BNⅡ系統的平均偏差為－0.31 mg/L;Cys C濃度在5.0 mg/L 以上時與BNⅡ系統偏差較大，高濃度樣本檢測比實際濃度偏低，可能是由于鉤狀效應的影響。當抗原量過剩時而出現的后帶現象，導致免疫復合物的降低，應當稀釋樣本后重新進行測定。這也說明C系統的檢測線性低于BNⅡ系統。F系統與BNⅡ系統的平均偏差為0.36 mg/L，有研究報道顯示SPIA 與PENIA 有0.27 mg/L［14］或 32.7%［15］的正偏差，與本研究結論相似。其他4個系統(A、B、D、E)與BNⅡ系統的偏差相差不大，但E系統的百分偏差為14.48%，接近 CLIA'88建議的 TEa(靶值±15%)。可能是由于E系統的空白限偏高(為0.1 mg/L)，導致 Cys C 在0.8 mg/L以下的低濃度時與BNⅡ系統比較的百分偏差較大。有報道顯示PETIA較PENIA有－0.16 mg/L的負偏差［16］，還有文獻［17］報道稱 PETIA 較 PENIA 有－0.009 mg/L 的負偏差，另有文獻［15］報道顯示PETIA較 PENIA有24.5%和27.6%的正偏差。這可能是由于市場上銷售的Cys C試劑廠家眾多，每種試劑中Cys C抗體的效價不同，尤其是各檢測體系的校準品溯源不統一，校準品賦值存在差異，造成產品差異很大，嚴重影響其檢測結果的準確性。如果采用準確賦值的校準品，有可能使不用檢測體系對同一份樣品的檢測結果基本一致。本研究的不足之處是未能采用ERM-DA471驗證各檢測體系校準品賦值的準確性。

綜上所述，A、B、D 3個系統的各項性能指標基本滿足臨床試驗的要求;部分廠家Cys C檢測試劑的準確性欠佳，且不同系統間結果存在一定偏差，是否可通過校正因子或統一校準品進行糾正，從而使檢測結果在不同系統間達到一致可比有待進一步驗證。臨床應用中，實驗室應選用分析性能優越的檢測系統，通過參加室間質評或其他渠道驗證其正確度。

［1］Dharnidharka VR，Kwon C，Stevens G.Serum cystatin C is superior to serum creatinine as a marker of kidney function:a meta-analysis［J］.Am JKidney Dis，2002，40(2):221-226.

［2］李海霞，吳紅花，徐國賓，等.血清半胱氨酸蛋白酶抑制劑C與肌酐在評價糖尿病患者腎小球濾過功能中的比較研究［J］.中華檢驗醫學雜志，2005，28(6):602-605.

［3］Clinical and Laboratory Standards Institute.Evaluation of precision performance of quantitative measurement methods;approved guideline-second edition［S］.EP5-A2，CLSI，2004.

［4］余 霆，胥 勁，黃 麗，等.膠乳增強免疫透射比濁法測定Cys C的性能評價［J］.中國輸血雜志，2010，23(3):191-194.

［5］Centers for Medicare and Medicaid Services.Clinical laboratory improvement amendments of 1988［S］.CLIA88，CMS，1988.

［6］Reinhard M，Erlandsen EJ，Randers E.Biological variation of cystatin C and creatinine［J］.Scan J Clin Lab Invest，2009，69(8):831-836.

［7］Bandaranayake N，Ankrah-Tetteh T，Wijeratne S，etal.Intra-individual variation in creatinine and cys-tatin C［J］.Clin Chem Lab Med，2007，45(9):1237-1239.

［8］Toffaletti JG，McDonnell EH.Variation of serum creatinine，cystatin C，and creatinine clearance tests in persons with normal renal function［J］.Clin Chim Acta，2008，395(1-2):115-119.

［9］Clinical and Laboratory Standards Institute.User demonstration of performance for precision and accuracy;approved guideline-second edition［S］.EP15-A，CLSI，2001.

［10］Clinical and Laboratory Standards Institute.Protocols for determination of limits of detection and limits of quantitation;approved guideline［S］.EP17-A，CLSI，2004.

［11］Clinical and Laboratory Standards Institute.Interference testing in clinical chemistry;approved guideline-second edition［S］.EP7-A2，CLSI，2005.

［12］Clinical and Laboratory Standards Institude.Method comparison and bias estimation using patient samples;approved guideline-second edition［S］.EP9-A2，CLSI，2002.

［13］趙世巧，陳忠余，梁 華，等.以國際通用標準評價五種胱抑素C試劑的方法學性能［J］.國際檢驗醫學雜志，2012，33(13):1584-1586.

［14］程黎明，朱曉華，朱耀武，等.液相免疫膠體金技術用于檢測血漿半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的方法學評價［J］.檢驗醫學，2010，25(3):214-218.

［15］國秀芝，邱 玲，劉 荔，等.三種應用于自動生化分析儀的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C試劑的分析性能驗證［J］.中華檢驗醫學雜志，2011，34(6):561-567.

［16］李海霞，王學晶，徐國賓，等.兩種不同檢測系統測定半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的方法學評價［J］.中華檢驗醫學雜志，2007，30(11):1284-1287.

［17］謝 媛，李 丹，徐丙根，等.兩種測定血清半胱氨酸蛋白酶抑制劑C方法的結果比較［J］.檢驗醫學，2008，23(5):520-522.