B抗原減弱表型的表型頻率與ABO基因分析

池 泉，張 愛，任本春

(福建省血液中心，福建福州350004)

ABO亞型通常根據(jù)其血清學(xué)特征進(jìn)行分類，A 亞型可分為A2、A3、Aend、Ax、Am、Ay、Ael等，B 亞型的分類通常參照A亞型，但沒有B2［1］。然而在日常ABO血型鑒定過程中，經(jīng)常可遇到B抗原表達(dá)減弱(凝集強(qiáng)度中等)的樣本，有些還可產(chǎn)生不規(guī)則抗-B，其血清學(xué)表現(xiàn)不符合B3、Bx、Bm和Bel等亞型的分類標(biāo)準(zhǔn)，在國內(nèi)曾一度被認(rèn)為應(yīng)判定為B2亞型［2］。ABO基因變異導(dǎo)致糖基轉(zhuǎn)移酶活性改變，是紅細(xì)胞上A或B抗原表達(dá)異常的最常見原因。但以往對(duì)此類B抗原減弱表型多以血清學(xué)分析報(bào)道為主，未進(jìn)行進(jìn)一步的ABO基因分析。為更好地了解B抗原減弱表型的分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)，我們?cè)谌粘Ｑ丸b定過程中收集了部分具有該特征的B型或AB型個(gè)體血液樣本，對(duì)其血清學(xué)和ABO基因進(jìn)行了初步分析。

材料和方法

一、研究對(duì)象

從2007年至2010年間在福建省血液中心獻(xiàn)血的獻(xiàn)血者241 952例中篩查出的B抗原減弱的獻(xiàn)血者及部分家系成員。所有樣本均為乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝全血。

二、血型血清學(xué)鑒定

采用單克隆抗-A、抗-B(上海血液生物制品公司產(chǎn)品)和A、B、O型紅細(xì)胞(實(shí)驗(yàn)室自制)，對(duì)所有獻(xiàn)血者進(jìn)行ABO血型鑒定(正反定型，微孔板法);采用單克隆抗-A、抗-B、抗-H(上海血液生物制品公司產(chǎn)品)和人源抗-A、抗-B血清及A、B、O型紅細(xì)胞(實(shí)驗(yàn)室自制)，用試管法凝集試驗(yàn)對(duì)篩查出的B抗原減弱個(gè)體(微板法呈弱凝集)及家系成員血樣進(jìn)行B抗原減弱表型的確認(rèn)和血清學(xué)分析。

三、標(biāo)本的DNA提取

使用基因組DNA純化試劑盒(Qiagen公司產(chǎn)品)按照試劑說明書抽提B抗原減弱個(gè)體及家系成員樣本的基因組DNA，用于ABO基因的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增與測序分析。

四、ABO基因第6、7外顯子及第6內(nèi)含子PCR擴(kuò)增

以人類ABO基因(GenBank Accession Number NC_000009)為模板，應(yīng)用 Primer3 Input軟件(V0.4.0)(http://frodo.wi.mit.edu/primer3/)在線設(shè)計(jì)引物(F1:5'-GTGGTCAGAGGAGGCAGAAG-3'，R1:5'-TGTGTGTGATTTGAGGTGGG-3')用于擴(kuò)增第6、7外顯子及第6內(nèi)含子共2 145 bp片段。PCR反應(yīng)體系包括:dNTP 400μmol/L，Mg2+2.5 μmol/L，10×PCR 緩沖液5 μL，Taq 酶0.5 U，模板 DNA 500 ng，引物10 pmol/L，終反應(yīng)體系50μL;循環(huán)參數(shù):94℃熱啟動(dòng)3 min，94℃ 30 s，55℃ 40 s，72℃ 130 s;30個(gè)循環(huán)后 72℃10 min。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

五、ABO基因第6、7外顯子及第6內(nèi)含子序列分析

PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后直接測序，測序引物為F1、R1、F2(5'-AGAGGATGCTGGCAGAGCCGTGGTC-3')、R2(5'-GGTGCCGAACAGCGGAGTCAGGAT3')。用Chromas 2.01軟件閱讀測序圖譜，使用 DANMAN5.22軟件將測定序列與B101序列進(jìn)行比對(duì)。

結(jié) 果

一、血清學(xué)檢查結(jié)果

從241 952名獻(xiàn)血者(扣除重復(fù)獻(xiàn)血者后，其中B型59 979名、AB型16 505名)中共檢出B抗原減弱13例(其中B型9例、AB型4例)。據(jù)此估計(jì)，B抗原減弱表型在福建省人群中的頻率約為1∶18 000，其中在B型人群中的頻率約為1∶7 000，在AB型人群中的頻率約為1∶4 000。檢出樣本的血清學(xué)檢查結(jié)果見表1。

表1 13例B抗原減弱樣本的血清學(xué)檢查與ABO基因分型結(jié)果

二、ABO基因分析

根據(jù)各樣本ABO基因第6、7外顯子及第6內(nèi)含子的序列比較結(jié)果，13例B抗原減弱樣本的ABO基因型分別為:A102/Bw121例，B101/B101 2例，B101/O01 4例，B101/O02和 A102/B101各3例(見表1)。除在13號(hào)樣本中檢出Bw12等位基因外，其余樣本的ABO基因均為常見等位基因。

三、家系調(diào)查

對(duì)1例基因型為B101/O01的獻(xiàn)血者(8號(hào))進(jìn)行了家系成員的血型檢測和分析，先證者父親檢出為具有相同的B抗原減弱表型，ABO基因型為B101/O01(見圖1)。

圖1 8號(hào)獻(xiàn)血者的家系調(diào)查結(jié)果

討 論

B亞型的血清學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)至今仍較不明確，其分類通常參照 A亞型，但沒有 B2亞型。Salmon［3］曾在1976年提出參照A亞型的標(biāo)準(zhǔn)簡單將 B 亞型分為B3、Bx、Bm、Bel，同時(shí)將不符合這4類亞型標(biāo)準(zhǔn)的其它弱表型歸為Bw。對(duì)于B亞型血清學(xué)分類的討論或共識(shí)較少，可能與高加索人群中B型以及B亞型的頻率較低且案例較少有關(guān)。血型及其亞型在不同的人群中有不同的分布特征，例如在高加索人群中A2亞型約占A型人的20%，而在漢族人群則僅為0.5%;與西方人群A亞型頻率高于B亞型的情況相反，東方人群的B亞型頻率要高于A亞型。日本的Yamaguchi等［4］在對(duì)700 000名獻(xiàn)血者的血型分析中，Bx和Bm的頻率要高于Ax和Am;向東等［5］報(bào)道的上海地區(qū)ABO亞型的分析中，B亞型的頻率也明顯高于A亞型。

雖然B亞型分類中并無B2亞型，但上世紀(jì)90年代，我國曾有不少針對(duì)B型中是否存在B2亞型的討論，并相繼有10例以上的血清學(xué)個(gè)例分析報(bào)道［2，5］。有學(xué)者認(rèn)為在B亞型分類中納入與A2亞型相對(duì)應(yīng)的B2亞型符合中國人群的實(shí)際［6］。概括所謂B2亞型的血清學(xué)特征主要為:紅細(xì)胞與抗-B的凝集強(qiáng)度介于正常 B型與B3之間，與抗-H的凝集強(qiáng)度介于O細(xì)胞與B細(xì)胞之間，部分個(gè)體血清中可檢出不規(guī)則抗-B。本研究中各樣本紅細(xì)胞與抗-B的反應(yīng)強(qiáng)度均在2+左右，與抗-H的反應(yīng)強(qiáng)度均增強(qiáng)，有2例樣本檢出了不規(guī)則抗-B，血清學(xué)特征與以往報(bào)道的B2亞型相似。本研究的篩查顯示該表型在人群中具有一定的分布頻率，其他地區(qū)該表型的人群頻率、血清學(xué)特征，有待于更多研究者的進(jìn)一步的識(shí)別、研究和分析。由于本研究B抗原減弱表型的篩查僅采用一個(gè)廠家生產(chǎn)的單克隆抗體試劑進(jìn)行，若該類抗原減弱由部分抗原表位的缺失引起，采用來自不同克隆株的單克隆抗體試劑可能會(huì)得到不同的結(jié)果和發(fā)現(xiàn)。

ABO血型抗原的弱表達(dá)受多種因素的影響，其中以ABO基因酶催化活性區(qū)域的編碼序列錯(cuò)義突變最為常見，是形成 ABO亞型的主要原因［1］。另外如ABO基因酶催化活性區(qū)域外的編碼序列錯(cuò)義突變、糖基轉(zhuǎn)移酶分泌不足、前體物質(zhì)的變異或缺乏、其他轉(zhuǎn)移酶的合成干擾等，也可能引起ABO血型抗原的弱表達(dá)。ABO基因全長18 kb，包含7個(gè)外顯子，其中第6和7外顯子占全部編碼序列的77%。編碼91%的ABO糖基轉(zhuǎn)移酶催化活性區(qū)域，目前已報(bào)道的大多ABO亞型相關(guān)等位基因的點(diǎn)突變發(fā)生在該區(qū)域［7］。本研究中1例樣本在第6外顯子檢出了278C＞T的突變(Bw12等位基因)，該突變導(dǎo)致B基因編碼產(chǎn)物的第93位氨基酸由脯氨酸(Pro)轉(zhuǎn)變?yōu)榱涟彼?Leu)。Bw12等位基因由許國先等［8］在1例 ABw亞型(與抗-B凝集強(qiáng)度為w)個(gè)體中首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道，為稀有等位基因。與之不同，本研究中的該例樣本B抗原中度減弱，與抗-B的凝集還強(qiáng)于本研究中的其他B抗原減弱樣本(見表1)。本研究從B抗原減弱個(gè)體中檢出該等位基因，再次表明278C＞T突變對(duì)酶產(chǎn)物的活性具有一定影響，同時(shí)也再次驗(yàn)證ABO血型抗原的合成機(jī)制受多種因素影響，不同個(gè)體間即便含有相同的等位基因或突變也可能有著不同的血清學(xué)表現(xiàn)。本研究其余12例樣本的第6和7外顯子序列與常見等位基因相同，未發(fā)現(xiàn)存在突變，但其中1例的家系調(diào)查結(jié)果卻提示B抗原減弱表型存在遺傳的可能。已有研究表明［9-10］，部分ABO亞型的形成與ABO基因第1至5外顯子、啟動(dòng)子區(qū)域和CBF/NF-Y增強(qiáng)子區(qū)域的突變有關(guān)，因此還需對(duì)ABO基因的其他序列進(jìn)行檢測，以明確這些弱表達(dá)是由ABO基因的其他區(qū)域突變引起，還是受非ABO基因的因素影響。

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