酶抑制法測定m-AST試劑性能評價及其在肝病中的意義

李 君， 謝勁松， 臧桂珍

(東南大學醫學院附屬南京第二醫院檢驗科，江蘇南京210003)

血清中天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)有2種受不同基因控制的同工酶，分別為來自細胞質中的同工酶(c-AST)和來自線粒體的同工酶(m-AST)。AST廣泛存在于人體各組織細胞中，尤以心、肝含量最高。c-AST升高表示細胞膜通透性改變，m-AST活性增高表示線粒體膜通透性增加或細胞壞死。因此m-AST檢測更能夠客觀地反映細胞的受損程度［1］。檢測m-AST活性的方法很多，酶抑制法是近年推出的測定m-AST的新方法。我們對酶抑制法測定m-AST的方法學進行性能評價，并檢測了正常人和不同肝病患者血清AST和m-AST。

材料和方法

一、研究對象

選取東南大學醫學院附屬南京第二醫院2011年11月至2012年3月住院的肝病患者259例，其中男149例，女110例，年齡18～75歲;根據2000年全國第10次病毒性肝炎與肝病學會議制定的診斷及分型標準［2］確診，包括急性肝炎43例、慢性病毒性肝炎95例、肝衰竭20例、重型肝炎11例、肝硬化代償期40例、肝硬化失代償期9例、原發性肝癌41例。選擇同期在東南大學醫學院附屬南京第二醫院體檢中心進行體檢的健康人220名作為正常對照組，男130例，女90例，年齡18～70歲，均無心、腦、肝、腎等系統疾病。

二、方法

采用酶抑制法測定m-AST活性，試劑中含有的蛋白酶可以完全抑制c-AST的活性，而m-AST活性不受影響，用速率法測定剩余AST活性既為m-AST活性。NADH在340 nm處有特異性吸收峰，而在AST催化過程中 NADH易被氧化成NAD+，且氧化速率與AST活性成正比，所以AST活力可以用340 nm處測得的NADH吸光度的下降速率表示。

三、標本收集

清晨空腹采集外周血3.0 mL，分離血清，所有標本均無溶血和脂血現象，在2 h內完成檢測。

四、試劑與儀器

m-AST試劑盒及配套校準品和質控品由寧波普瑞柏生物技術有限公司提供，AST檢測試劑盒及配套校準品由北京萊邦生物技術有限公司提供，按試劑盒說明書在HITACHI7600-120全自動生化分析儀上編制好實驗參數，用配套校準品校準，室內質控在控后測定標本。

五、方法學評價

1.精密度試驗 收集低(25.3 U/L)、中(107.3 U/L)、高(213.0 U/L)3 個濃度的患者混合血清標本，連續檢測20次，計算批內精密度［變異系數(CV)］。再用上述標本連續測定20 d，上、下午各測1次，計算批間精密度(CV)。

2.回收試驗 準備1份混合血清，分4份，每份1mL，在每份血清中分別加入濃度為113 U/L的 m-AST 標準品0、0.1、0.2、0.3 mL，再分別加入生理鹽水 0.3、0.2、0.1、0 mL，通過測定值減去各自原血清濃度確定回收量和回收率。

3.線性試驗 取濃度為452 U/L(儀器自動稀釋測得結果)的混合血清，用生理鹽水按1∶6、2∶5、3∶4、4∶3、5∶2、6∶1、原倍稀釋，結果分別為66.8、131.2、195.9、260.4、323.6、389.9、456.2 U/L。以理論值為Y、測定值為X計算回歸方程。

4.c-AST抑制試驗 取新鮮肝臟標本，用0.25 mol/L蔗糖溶液攪勻，高速離心，取上清，用二乙氨基乙基纖維素柱色譜法提純。初步提純的m-AST和c-AST再分別依次在磷酸鹽緩沖液(100 mol/L，pH 值 5.5)中層析 25 h，在Tris緩沖液(80 mol/L，pH 值 7.6)中層析 12h，聚乙二醇20000濃縮。純化的m-AST和c-AST分別用生理鹽水配制成3個不同的濃度，再用m-AST和AST試劑(不含抑制酶)分別檢測。

5.比對試驗 將40份血清標本(范圍為3.0～200.0 U/L)同時用酶抑制法(Y)和免疫抑制法(X)(試劑由上海玉蘭生物技術研究所生產)在HITACHI7600-120全自動生化分析儀上檢測。

6.溶血干擾試驗 在高、低2種m-AST濃度的混合血清中分別加入稀釋好的不同濃度的血紅蛋白(Hb)液，使 Hb 濃度分別為0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 g/L，對照管中加入同體積蒸餾水，檢測m-AST濃度。

7.試劑穩定性 將試劑置于室溫(25℃)，每1 h測1次試劑空白吸光度(A)值;將液體試劑置于4℃冰箱保存，每月測1次試劑空白A值。

五、統計學方法

采用Microsoft Excel2003和SPSS17.0統計軟件進行數據處理，計量結果用±s表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、精密度試驗

低(25.3 U/L)、中(107.3 U/L)、高(213.0 U/L)3個濃度標本的批內CV分別為2.23%、0.59%、0.61%，批間 CV 分別為5.45%、5.24%、6.23%。

二、回收試驗

3個濃度回收率均在90%～110%以內，平均回收率為104.97%，屬可接受范圍。見表1。

表1 回收試驗(%)

三、線性試驗

以理論值為Y、測定值為X計算回歸方程為Y=0.997X－1.51，相關系數(r)=0.999 9。酶抑制法檢測m-AST在450 U/L范圍內線性良好。

四、c-AST抑制試驗

分別采用m-AST和AST試劑(不含抑制酶)檢測 m-AST純品，檢測結果分別為12、60、304 U/L和 11、62、306 U/L，差異無統計學意義(P=0.4);c-AST 純品的檢測結果分別為0.1、0.2、0.2 U/L和 92、378、1 504 U/L。說明酶抑制法 m-AST試劑可完全抑制1 500 U/L的c-AST活性，但不影響m-AST活性。

五、比對試驗

同時采用酶抑制法(Y)和免疫抑制法測定40份血清樣品的回歸方程為Y=0.985 7X－0.250 4，r=0.999 8。

六、溶血干擾試驗

當 Hb 濃度分別為0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 g/L、m-AST 濃度為11.55 U/L 時，偏差分別為0.9%、8.6%、16.7%、42.5%、72.3%;當m-AST濃度為44.55 U/L時，偏差分別為0.6%、4.7%、8.1%、11.3%、21.9%。

七、試劑穩定性

將試劑置室溫(25℃)時，10 h之內A值無明顯改變;將液體試劑置4℃冰箱保存，6個月之內試劑空白A值基本不變。酶抑制法試劑的穩定性能較好。

八、參考區間

根據SPSS17.0統計軟件分析，男、女2組數據均呈正態分布。以95%可信區間(±1.96s)初步確定參考區間男性為3.1～9.5 U/L，女性為2.5～8.7 U/L，男、女性差異有統計學意義(P=0.000)，但均在試劑說明書提供的參考區間(≤10 U/L)內。正常成年人年齡間差異無統計學意義(P＞0.05)。

九、不同類型肝病患者m-AST濃度變化

各肝病組m-AST活性均高于正常對照組(P＜0.05、P＜0.01);m-AST 活性的改變與AST變化呈正相關。隨著肝細胞損害程度的不同，m-AST活性升高程度依次為重型肝炎＞肝硬化失代償＞急性病毒性肝炎＞肝衰竭＞慢性病毒性肝炎＞原發性肝癌＞肝硬化，各肝病組之間差異均有統計學意義(P＜0.05)。m-AST/AST比值除肝硬化失代償組外，其余各肝病組均低于正常對照組(P＜0.05);各肝病組中除肝衰竭組 m-AST/AST比值低于其他各組(P＜0.05)外，其余各組之間差異均無統計學意義(P＞0.05)，見表2。

表2 對照組及不同肝病組入院時血清m-AST與AST活性測定結果

討 論

m-AST測定早期采用電泳法、離子交換柱層析法等，操作繁瑣，受多種因素影響，變異較大，靈敏度低，特異性差;酶免疫法自動化程度低，均不適用于大批量操作。放射免疫法有污染、試劑保存期限短的缺點。近年來報道比較多的免疫抑制法雖特異、準確，自動化程度高，但此方法影響因素較多，尤其與抗體制備及比例有很大的關系，因此各單位測定值相差甚遠，文獻報道其線性范圍通常在120～200 U/L以下［3-5］。本研究使用酶抑制法檢測m-AST活性，具有較高精密度和回收率，有良好的準確度和較寬的線性范圍;適用于各種全自動生化儀，因此更適宜臨床推廣和應用。因紅細胞中m-AST含量較高，因此溶血對檢測結果影響較大。

血清AST屬非特異性酶，其升高對診斷具體疾病無特異性，在診斷肝病方面也沒有ALT靈敏，但對肝細胞損傷程度的評估是有價值的指標。m-AST 80%分布在線粒體內，正常人血清中AST主要是c-AST，m-AST含量很低甚至無。當肝細胞壞死、線粒體崩解時，附著在線粒體上的m-AST大量釋放血中，導致血清m-AST急劇升高。但m-AST在血清中易被網狀內皮系統清除，半衰期短，其清除率比c-AST快5倍以上，當細胞不再受破壞時，血清m-AST很快下降，甚至回復正常水平，故m-AST可作預后指標。

本研究各類肝病患者m-AST活性均高于正常對照組(P＜0.05)，并且隨著病情變化，m-AST活性的改變與AST變化呈正相關。隨著肝細胞損害程度不同，m-AST升高程度為重型肝炎＞肝硬化失代償＞急性病毒性肝炎＞肝衰竭＞慢性病毒性肝炎＞原發性肝癌＞肝硬化，各肝病組之間m-AST差異均有統計學意義(P＜0.05)，提示m-AST活性測定可作為判斷肝細胞損傷程度的可靠指標，對肝臟疾病的臨床分類和預后具有一定價值。

220名正常人 m-AST/AST比值為0.30±0.07，這與國外文獻［6］報道的10%以下有很大不同，而國內不同文獻報道差異很大［5，7-9］，主要原因可能與方法學不同有關，近年文獻報道均為免疫抑制法，此法影響因素較多。本研究結果還顯示除失代償期肝硬化患者外，其余各組患者的m-AST/AST比值低于正常對照組(P＜0.05)，與毛小紅［8］的報道一致。肝衰竭患者m-AST/AST比值低于其他各組(P＜0.05)外，其余各組間差異無統計學意義(P＞0.05)。表明m-AST/AST比值的變化不如m-AST活性變化明顯，原因為肝細胞發生嚴重損傷時m-AST大量釋放，但m-AST清除率比c-AST快，故血清中m-AST與總AST活性同步升高。因此m-AST絕對值臨床意義更重要。

本研究失代償期肝硬化患者m-AST與AST的相關系數僅為0.61。原因可能與患者病情加重、酶膽分離有關，但因病例數太少，尚需進一步研究。

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